恒温条件下采收时机对铁皮石斛多糖的影响

王琦+刘京晶+斯金平+朱玉球+秦朗+张菊玲

[摘要]为揭示铁皮石斛多糖积累的规律，明确采收时机对铁皮石斛多糖的影响，该研究在组培室恒温条件下，于2015年12月至2016年11月预培养铁皮石斛D21无性系小苗至1 cm左右，然后转接培养2～5个月后采收，用苯酚硫酸法测定多糖含量、柱前衍生UPLC分析单糖组分的差异，结果显示多糖及其关键组分甘露糖的含量与培养月龄呈正相关，但各种培养月龄多糖含量均在5—6月份具有峰值，并与大田种植条件下的趋势吻合，表明即使在组培室恒定条件下，采收季节仍然显著影响多糖及其组分的含量，这种植物内在调控的多糖积累动态变化趋势可能与铁皮石斛固有的感知四季变化的生命节律有关。

[关键词]铁皮石斛； 采收季节； 培养月龄； 多糖； 单糖

[Abstract]In order to reveal the accumulation trend of polysaccharides in Dendrobium catenatum and determine the effect of sampling time on polysaccharides， D Catenatum D21 clone was harvested from January to December after culturing for 2 to 5 months in the growth chamber with constant temperature Polysaccharides were determined by phenolsulfuric acid method and the monosaccharide compositions were analyzed by precolumn derivativeUPLC The results showed that the content of polysaccharide and its key component mannose was positively correlated with the culture time， but the contents of polysaccharides in all kinds of culture peaked from 5 to 6 months， which were consistent with the trend of field planting The results suggested that the trend of polysaccharide accumulation in the plant could be related to the life rhythm of the sensory seasons of D catenatum， which was significantly affected by the harvesting season， even under the constant condition of the culture chamber.

[Key words]Dendrobium catenatum； sampling time； culture time； polysaccharides； monosaccharide composition

鐵皮石斛Dendrobium catenatum （D officinale）[1]是我国传统名贵中药材，具有增强免疫力、抗肿瘤、滋阴清热、益胃生津等功效[2]。20世纪90年代以来，随着铁皮石斛产业化关键技术的突破，产业得到迅速发展[37]，但目前仍然存在生产周期长、成本高，产品质量易受环境影响等问题，因而有学者提出组培、发酵工厂化生产的建议。为此，本文以无菌、恒温培养的铁皮石斛无性系为研究对象，以其主要的功效成分多糖为评价指标，研究恒温条件下采收季节与培养月龄对铁皮石斛多糖及其组分的影响，探索铁皮石斛多糖积累机制与工厂化生产的可行性。

1材料与方法

11样品供试材料为铁皮石斛D21无性系，由浙江农林大学国家林业局铁皮石斛工程技术研究中心自主选育。供试幼苗在接种后在（24±1） ℃，16 h·d-1光照条件下无菌培养。

2015年12月至2016年11月预培养铁皮石斛D21无性系小苗至1 cm左右，然后挑选生长状态相似，高度约为1 cm的铁皮石斛组培苗转接于玻璃瓶（直径55 cm，高105 cm）内，每瓶10株。并按此方法处理：每月25日分别对供试组培苗进行转接，共12批次，每一批次包括4个处理，分别培养2，3，4，5个月的供试组培苗，每个处理为30瓶。

12仪器与试剂AB104N电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；DKS24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；DHG9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（Thermo Scientific GENESYS 10s UVVIS）；D37520型高速离心机（德国Heraeus公司）；Acquity超高效液相色谱仪（PDA检测器，美国Waters公司）。

重蒸酚（国药集团化学试剂有限公司）；1苯基3甲基5吡唑啉酮（PMP）为化学纯；甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖对照品全部购于中国食品药品检定研究

院（批号分别为140651200602，111683200401，111646200301，110833200503，02269602，1508200001，1506200203）；其余所用试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

13多糖含量和单糖组分分析将培养特定时间后的组培苗取出，洗净培养基后去除根部和叶片，将茎置于60 ℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，干燥器储存待用。茎多糖量测定采用苯酚硫酸法，单糖采用柱前衍生方法[5]。色谱条件为：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（21 nm×150 nm，17 μm）；柱温30 ℃；流动相 002 mmol·L-1乙酸铵乙腈，梯度洗脱；流速 02 mL·min-1；进样量5 μL；检测波长254 nm。endprint

2结果与分析

21采收时机对茎多糖量的影响采收季节和培养月龄对铁皮石斛D21茎多糖量存在显著影响（表1）。不同采收季节的样品从整体上看多糖量随着培养月龄增加而增加。培养月龄相同的D21无性系采收季节不同其多糖量存在显著差异，其中5—6月采收多糖量最高，培养月龄3个月，5月份采收多糖量为943%，超过全年均值5778%；培养月龄4个月，5月份采收多糖量达到1183%，超过全年均值5744%；培养月龄5个月，6月份采收多糖量达到1327%，超过全年均值5962%。该变异规律与大田栽培DD21（曾用名6A2B）[7]存在显著的相关性（图1）。这表明在恒定培养条件下，铁皮石斛多糖含量仍然存在动态变化，且与大田栽培的趋势一致。

为了确切地反映培养月龄、采收季节及交互作用对铁皮石斛D21多糖量的影响，采用双因素方差分析，结果显示培养月龄、采收季节及培养月龄×采收季节交互均对多糖量存在极显著影响（表2），其影响大小为培养月龄>采收季节>培养月龄×采收季节。

22采收时机对单糖组成的影响供试铁皮石斛D21单糖衍生后检测出5种单糖成分，分别为甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖（图2）。铁皮石斛D21多糖中各单糖量在不同采收季节和培养月龄下均存在明显差异，其主要组分甘露糖，从整体上看随培养月龄增长的变化趋势与多糖量变化一致，培养月龄相同的甘露糖积累较明显的季节为5—6月；不同采收季节单糖含量及其比例存在显著差异，说明不同采收季节多糖的组分也存在显著差异（表3）。

1甘露糖；2鼠李糖；3葡萄糖醛酸；4半乳糖醛酸；5葡萄糖；6半乳糖；7阿拉伯糖。

3结论与讨论

铁皮石斛D21无性系在组培室恒温环境条件下培养，培养月龄、采收季节（对应自然季节）均显著影响多糖量及其组分。培养月龄（苗龄）与多糖及其关键组分甘露糖的含量存在显著的正相关，但培养月龄相同、采收季节不同的铁皮石斛D21多糖量变化规律与大田栽培基本一致，在5—6月份多糖含量最高。研究结果表明在外界条件恒定的情况下，铁皮石斛多糖含量及其组分仍然具有季节性的动态变化，这可能由植物内在感知季节规律的生物钟调控有关。这种多糖积累动态变化，使铁皮石斛在无菌、恒温培养条件下周年循环生产中无法获得稳定多糖产量与组分，从而需要进一步探索铁皮石斛工厂化生产的工艺。

[参考文献]

[1]斯金平，张媛，罗毅波，等.石斛与铁皮石斛关系的本草考证[J]. 中国中药杂志，2017，42（10）：2001.

[2]中国药典一部[S].2015：282.

[3]斯金平，王琦，劉仲健，等.铁皮石斛产业化关键科学与技术的突破[J]. 中国中药杂志，2017，42（12）：2223.

[4]诸燕，斯金平，郭宝林，等.人工栽培铁皮石斛多糖含量变异规律[J]. 中国中药杂志，2010，35（4）：427.

[5]苑鹤，白燕冰，斯金平，等.柱前衍生HPLC分析铁皮石斛多糖中单糖组成的变异规律[J]. 中国中药杂志，2011，36（18）：2465.

[6]章晓玲，刘京晶，吴令上，等.铁皮石斛F1代多糖和醇溶性浸出物变异规律研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（21）：3687.

[7]俞巧仙，郭英英，斯金平，等.铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物动态累积规律研究[J]. 中国中药杂志，2014，39（24）：4769

[责任编辑吕冬梅]endprint