款冬叶柄愈伤组织培养与再生体系建立

任继文　雷颖　李晓玲

[摘要]以款冬幼嫩叶柄为材料，研究植物生长调节剂对其离休培养与植株再生的影响，建立了款冬离体快繁技术体系。结果表明：款冬叶柄切段较理想的灭菌方法为75%乙醇浸泡30 s，转入饱和漂白粉上清液浸泡15 min；适合愈伤诱导的培养基为MS+6BA 30 mg·L-1+2，4D 20 mg·L-1，诱导率962%；在培养基MS+ZT 20 mg·L-1+NAA 03 mg·L-1上芽苗分化效果较好，分化率91%，平均芽数826个；较佳的不定芽增殖培养基为MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1，增殖倍數为1181，平均苗高49 cm；生根培养基为1/2MS+IBA 02 mg·L-1，生根数平均为568条，生根率为9522%以上；瓶苗移栽于河沙有机肥 3∶1的基质中生长良好，成活率达90%以上；大田试验表明：同等栽培条件下款冬组培株、栽培株和野生株在生长量与花粒产量等方面存在显著差异，以组培株生长量与花粒产量相对较高。组培品与野生品有效成分含量基本一致。

[关键词]款冬； 幼嫩叶柄； 愈伤组织诱导； 植株再生； 生长量； 有效成分测定

[Abstract]Young petiole of Tussilago farfara was used as the material to investigate the plant growth regulators which could influence in vitro culture and plant regeneration and to establish rapid propagation technique The ideal sterilization method was that young petiole of T farfara was sterilized with 75% ethanol for 30 s， and then transferred to saturated bleaching power supernatant for 15 min The suitable medium for callus induction was MS+6BA 30 mg·L-1+2，4D 20 mg·L-1 with 962% induction rate The seedlings had better differentiation with 91% differentiation rate and 826 buds on the medium containing MS+ZT 20 mg·L-1+NAA 03 mg·L-1 The preferred enrichment medium of adventitious bud was MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1with 1181 enrichment times and 49 cm seedling height The rooting medium included 1/2MS+IBA 02 mg·L-1 with the average number of rooting was 586 and the rooting rate was above 9522% The container seedlings can grow well and the survival rate was more than 90% when they were transplanted on the medium added with river sand and organic fertilizer with the ratio of 3∶1. The field experiments indicated that significant differences in increment and yield of pollen grains among the tissueculture， cultivation and wild type of T farfara under the same cultivation conditions The cultivated plants were relatively high on the increment and yield of pollen grainsThe active ingredient contnet of the tissue culture and the wild materials was basically the same.

[Key words]Tussilago farfara； young petiole； callus induction； plant regeneration； measure； active ingredients

款冬Tussilago farfara Linn，又名款冬花，冬花，多年生草本，为菊科款冬花属植物[1]，其干燥花蕾，是我国传统的中药材，性味辛温，归肺经，具化痰止咳，润肺下气之功效，主治咳嗽、气喘、咳吐痰血等症[2]。亦可作为地被植物，用于花坛绿化[3]。随着在中成药，中药配方中应用的扩大，其需求量不断增大，目前商品款冬花以人工栽培为主，采用根茎无性繁殖，但品质逐年下降，而野生种质是丰产、优质、抗耐性品质的重要来源，但由于人为和自然等因素，野生资源逐渐减少，因此，促进中药产业的可持续发展，实施款冬花资源的保护和快速繁殖，已刻不容缓。对款冬花组织培养与快速繁殖的试验研究，目前还未报道见。本文利用野生款冬叶柄为材料，进行组织培养试验研究，以期获得高效再生体系的建立。

1材料

培养材料采自甘肃小陇山林区。初夏，采摘款冬当年生幼叶，用清水冲去表面灰尘后备用。endprint

2方法

21无菌材料的获得

款冬叶片上表面被蛛丝状毛，下表面及叶柄被白色毡毛，灭菌较为困难，因此在消毒液的各处理中加入2滴聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）[4]以加速消毒剂的浸润效果。本次试验采用2因素3水平完全随机试验设计[5]，设置75%乙醇处理30 s，01%HgCl（60，180，300 s），漂白粉上清液（600，900，1 200 s），共12个处理，每处理10瓶培养基，每瓶接1块外植体，重复3次。接种2周后检查污染率与褐变率。

22培养条件

培养基中加入3%的蔗糖，生根培养时加2%[6]，琼脂6 g·L-1，pH 58，愈伤诱导阶段pH 56[7]；培养温度为（22±2） ℃，光周期12 h/12 h （光/暗），生根培养时16 h/8 h （光/暗）；光照强度：愈伤诱导时约20 μmol·m-2·s-1 [8]，其他各阶段为50 μmol·m-2·s-1。

23愈伤组织培养

消毒灭菌所得的材料置于铺有无菌滤纸的接种盘中，切去两头褐化部分，将剩余部分切割成05～10 cm的小段[9]，接种到愈伤诱导培养基中，愈伤组织诱导以MS为基本培养基，采用6BA与2，4D的2因素3水平随机设计，共9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。弱光下培养 40 d后观察。愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的外植体数/接种后未被污染的外植体数×100%，接种后7 d记录生长情况[10]。

24不定芽分化培养

将外植体培养40 d后产生的优质愈伤组织块转接到不定芽分化培养基上。分化培养以MS为基本培养基，加入不同浓度的ZT与NAA，共9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种1块愈伤组织，重复3次。培养40 d后观察并统计分化率和平均芽数，不定芽分化率=萌芽的愈伤组织块/接种的愈伤组织块×100%； 平均芽数=萌芽总数/接种块数。

25嫩茎的增殖培养

将分化培养所得的簇生芽切下，较长嫩茎切成10cm左右的小段，转入增殖培养基上培养。增殖培养以MS为基本培养基，添加不同浓度的KT与IBA，共9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种3块幼茎，重复3次。培养40 d后观察并统计增殖倍数与平均苗高，增殖倍数=培养增长节位数（或芽苗数）/接种时节位数（或芽苗数）； 平均苗高=苗高总和/总苗数。

26试管苗生根

当不定芽长到2～3 cm时，切下芽苗转接到生根培养基上培养。生根培养以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的IBA和IAA，共6个处理，每个处理10瓶，每瓶接3～5条嫩茎，重复3次。培养30 d后观察并统计生根率与平均根数，生根率=生根茎段数/接种茎段数×100%； 平均根数=每处理生根总数/诱导生根的总苗数。

27移栽

将生根的瓶苗不开盖在炼苗室放置2～3 d，然后打开盖再放置2～3 d，取出苗，洗净根部培养基，移栽到河沙有机肥 3∶1的基质中，保持环境温度在20 ℃左右，相对湿度90%～100%，适当遮荫，每天下午通风，逐渐增加光照。计算移栽成活率=移栽成活数/总移栽数×100%。

28生长量测定

4月初，选择相同立地条件的试验地块，设置9个区组，每组5个小区，分别将同等大小的组培苗、栽培苗及野生苗移栽与试验小区内，每区组1个类型，重复3次。11月中旬统计测算各类型的生长量及花芽产量。各类型随机抽取10个样地，各样地面积1 m2，测算材料包括10个样地款冬的总株数。

29有效成分测定

291定性测定取组培和野生款冬花样品适量，粉碎（过20目筛）、60 ℃干燥到恒重，分别精密称取各样品1 g，用甲醇提取，浓缩后作为样品液。另取芦丁对照品，甲醇溶解为1 g·L-1溶液，作为对照品液。将样品液、对照品液点于同一硅胶G薄层板上，分别以醋酸乙酯甲酸水（10∶3∶3）和醋酸乙醋甲酸水（30∶1∶1）为展开剂，进行显色试验。

292定量测定采用美国TSP公司高效液相色谱仪，KeystoneODS色谱柱（46 mm×250 mm），预柱（15 mm），流动相甲醇03%磷酸水溶液（50∶50），流速1 mL·min-1，柱温为室温，检测波长360 nm，灵敏度002 AUFS。

在对照品溶液测定的芦丁峰面积与进样量有良好的线性关系，且精密度、重复性、回收率试验均符合要求的前提下，对组培品和野生品进行测试。

称取组培和野生款冬样品各1 g，分别置于100 mL圆底烧瓶中，加适量甲醇回流4 h，过滤，回收溶剂至干，再加甲醇盐酸（4∶1）25 mL，回流30 min，过滤，滤液定容至50 mL，微孔滤膜过滤，得供试品溶液。分别精密吸取供試品液和对照品溶液（002 g·L-1）各20 μL，注人色谱仪测定，以外标法计算含量。

3结果

31不同消毒剂对外植体灭菌的影响

在超净工作台上将清水冲洗过的幼叶剪去叶片，叶柄剪成2～3 cm小段，放入各处理的消毒瓶中，按设计方案（表1）进行消毒灭菌后，接种于相应的培养基中，01%升汞和饱和漂白粉上清液的各处理单独使用时污染率都相对较高，与75%乙醇配合使用时效果明显提高，各处理在P<001水平上差异显著，75%乙醇+01%升汞各处理污染率明显小于75%乙醇+饱和漂白粉上清液，但褐变率却明显高于后者，综合分析本轮试验结果，75%乙醇30 s+饱和漂白粉上清液900 s是款冬叶柄外植体较理想的消毒试验组合。

32不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响

选择灭菌试验中所得的无菌材料转接到愈伤诱导培养基中，1周后叶柄切段肥大，下端切口处有澎大的愈伤现象（图1A），40 d后观察，各处理愈伤组织块明显增大，但不匀一，部分愈伤块淡黄绿色、较致密、且表面有小疣突。 6BA和2，4D对愈伤组织诱导的效果显著，诱导率及平均直径随6BA和2，4D浓度的升高而增大，但当两者质量浓度分别大于30和20 mg·L-1时，诱导率下降，愈伤组织松散透明，失去了不定芽分化的能力（表2）。综合分endprint

析表明，MS+2，4D 20 mg·L-1+6BA 30 mg·L-1是较为理想的愈伤组织诱导培养基，诱导率为962%，愈伤组织块大、致密，表面有小疣突，有较好的不定芽分化能力（图1B）。

A培养2周的外植体； B培养40 d的愈伤组织块；C不定芽分化20 d；D不定芽分化40 d；E继代培养40 d； F生根培养30 d；G培养30 d的根形态； H炼苗第5天；I移栽成活的试管苗。

33不同植物生长调节剂组合对不定芽分化的影响

将淡黄绿色较致密的愈伤组织转接于分化培养

基上，20 d后有少量不定芽产生（图1C），40 d长出密集的绿色不定芽（图1D）。ZT和NAA对芽苗分化有显著影响，在不同植物生长调节剂组合中，以添加ZT 20 mg·L-1，NAA 03 mg·L-1的MS培养基较适合不定芽的分化，分化率为91%，平均芽数826个，芽苗生长健壮（表3）。

34不同植物生长调节剂组合对嫩茎增殖的影响

KT与IBA对芽苗增殖的影响显著，增殖倍数随其浓度的升高而增加，但当KT和IBA质量浓度分别大于10，03 mg·L-1时，增殖倍数下降，且产生一定数目的玻璃苗，基部有较多愈伤组织（表4）。因此，综合考虑以上试验结果，款冬芽苗增殖培养较适宜的培养基为MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1，芽苗生长健壮，叶色深绿，增殖倍数为1181左右，平均苗高490 cm左右（图1E）。

35试管苗生根与移栽

丛生芽苗增殖培养几代后，转入生根培养基中培养，30 d后的培养结果显示： IBA和IAA对芽苗生根都有影响，IBA的影响﹥IAA，其中，在添加02 mg·L-1 IBA的1/2 MS培养基上，生根率为952%，平均生根数568条左右（图1F，G，H），明显高于其他各处理（表5）。将生根的试管苗移栽至河沙+有机肥3∶1的基质中，并保持温室温度25 ℃，相对湿度80%有利于款冬试管苗的移栽的成活[11]，20 d后成活率达90%（图1I）。

36生长量与产量测算

4月初，将同等大小的组培苗、栽培苗及野生苗移栽与相同立地条件的试验地内，保持养护管理技术一致，11月中旬统计测算生长量与花粒产量[1213]，。结果表明：3种类型在全株鲜重、单株花粒数、单株花重及小区平均产量等方面都存在显著差异，其中以组培苗的各种指标都远远超出了其他2种类型（表6）。

37组培品与野生品有效成分

试验结果显示：组培样品液与对照品液在同一硅胶G薄层板上分别用29展开剂展开后，用氨水熏，均显黄色斑点，证明组培品和野生品中均含芦丁及懈皮素。分别精密吸取各样品液及对照品液进行色谱测定，计算结果显示：组培和野生款冬花中芦丁质量分数分别为023%，025%。

4讨论

款冬叶柄被白色毡毛，灭菌较为困难，灭菌时可在消毒剂的各处理中加入2滴吐温80以加速消毒剂的浸润效果。75%的乙醇一直是较好的植物材料灭菌剂，但单独使用时效果并不理想，因此，本次试验采用了75%的乙醇处理30 s后与01% HgCl、饱和漂白粉上清液的不同处理配合，取得了良好的灭菌效果，其中75%乙醇30 s+饱和漂白粉上清液900 s是款冬叶柄较好的消毒试验组合，75%乙醇30 s与01%HgCl配比的各组合，虽然污染率都相对较低，但褐变率都相对较高，试验表明：漂白粉上清液对款冬外植体材料消毒效果较好，较长时间浸泡时造成的伤害也较小。

激素种类和浓度对款冬叶柄愈伤组织诱导与植株再生具有重要作用，细胞分裂素6BA与生长素2，4D对愈伤组织的诱导具有显著影响，但6BA明显﹥2，4D；植株再生的关键在于愈伤组织是否能分化出不定芽，本试验采用了具有较强活性的细胞分裂素ZT有效促进了不定芽的分化。

增殖培养阶段，KT与IBA对芽苗的增殖都有较显著的影响，但KT明显﹥IBA，且当浓度较高时会出现玻璃化[14]。IBA较高时基部会出现愈伤组织。

生根过程中，款冬茎段基部较易形成愈伤组织，不利于新根产生也影响移栽成活率，可适当增加光照和降低培养温度以减少愈伤组织的形成[8]。同时，培养基中营养元素浓度较高时，试管苗产生依赖性而不易生根[15]，降低培养基中的糖浓度，可促进根原基的形成[16]，试验中发现采用1/2MS+IBA 02 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，生根率可达952%，且生长健壮。采用河沙+有机肥3∶1基质，可提高试管苗的移栽成活率。

大田栽培試验阶段，组培株在全株鲜重、单株花粒数、单株花重及小区平均产量等方面都远远超过了栽培株与野生株，并且组内标准差较小，生长整齐，虽然与栽培株在平均粒重上差异不显著，但由于培养过程中激素的使用而增强了花芽分化，花粒数的显著提高以致使产量提高显著。

测定结果表明，组培和野生款冬花在有效成分及含量上基本一致，完全可以代替野生品入药，但其栽培产量远远大于野生种，因此，以组培快繁途径拯救野生款冬资源，建立工厂化、规模化的款冬花生产基地是切实可行的。

[参考文献]

[1]中国科学院植物研究所中国高等植物图鉴第2册[M]北京：科学出版社，1994：547.

[2]吴琪珍，张朝风，许翔鸿，等. 款冬花化学成分和药理活性研究进展[J]. 中国野生植物资源，2015，34（2）：9.

[3]姚德生，任继文，樊辉甘肃野生花卉[M]兰州：甘肃科学技术出版社，2001：100.

[4]谭文澄，戴策刚观赏植物组织培养[M]北京：中国林业出版社，1997：43.

[5]吴玲利，柯镔峰，龚春，等. 白木通组织培养及快速繁殖[J]. 植物生理学报，2015，51（6）：903.

[6]刘敏花卉组织培养与工厂化生产[M]北京：地质出版社，2002：60.

[7]邬秀宏， 李中林， 陈正明，等. 茶树组织培养中外植体褐化控制的研究[J]. 西南农业学报，2012，25（3）：1065.

[8]沙月娥，欧阳乐军，彭舒桉树胚状体再生与遗传转化的研究进展[J]. 植物生理学报，2012，48（4）：325.

[9]张小红，张红燕，武军，等. TDZ对香椿愈伤组织诱导及芽增殖生长等的影响[J]. 西北农林科技大学学报，2002，30（5）：35.

[10]谭黎霞，田强强，王敦海棠花离体繁殖技术研究[J]. 西北林学院学报，2012，27（2）：93.

[11]宾宇波，沙海峰，任建武，等. 百花山葡萄组织培养和快速繁殖[J]. 西北林学院学报，2013，28（6）：99.

[12]刘毅款冬花规范化种植及质量标准的系统研究[D]成都：成都中医药大学，2008.

[13]张文辉，张绪成，管青霞栽植期和栽植深度对款冬花的影响初报[J]. 甘肃林业科技，2016（6）：18.

[14]曹孜义，刘国民实用植物组织培养技术教程[M]. 修定版.兰州：甘肃科学技术出版社，1999：66.

[15]王玉英，高新一植物组织培养手册[M]北京：金盾出版社，2006：97.

[16]任继文，雷颖金丝桃组织培养再生体系的建立[J]. 西北林学院学报，2010，25（3）：90

[责任编辑吕冬梅]endprint