基于特征图谱及多指标成分含量的冬虫夏草野生与人工繁育品比较研究

昝珂　黄莉莉　过立农　刘杰　郑健　马双成　钱正明　李文佳

[摘要]采用高效液相色谱法建立冬虫夏草野生及人工繁育品的特征图谱，并同时测定4种主要核苷的含量。以尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷等4种成分为对照品，采用Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）； 水（A） 乙腈 （B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，0% B；5～15 min，0～10% B，15～30 min，10%～20% B ；30～33 min，20%～50% B； 33～35 min，50%～0% B；35～40 min，0% B），流速06 mL·min-1，检测波长为260 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL，建立冬虫夏草野生品和人工繁育品的特征图谱，并同时测定4种主要核苷的含量。冬虫夏草人工繁育品和野生品之间特征图谱和4种主要核苷含量均无显著性差异，该研究能够为冬虫夏草人工繁育品的进一步开发利用提供科学依据。

[关键词]冬虫夏草； 野生品； 人工繁育品； 特征图谱； 核苷； 高效液相色谱

[Abstract]This study is to establish the HPLC specific chromatogram and determine four main nucleosides of wild and cultivated Cordyceps sinensis Uridine， inosine， guanosine and adenosine were selected as reference substance HPLC analysis was performed on a Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）， with a mobile phase consisting of water（A）acetonitrile （B） at a flow rate of 06 mL·min-1 （05 min，0% B；515 min，0%10% B， 1530 min，10%20% B， 3033 min， 20%50% B， 3335 min， 50%0% B， 3540 min， 0% B） The detection wavelength was 260 nm and the column temperature was controlled at 30 ℃， and the injection volume was 5 μL HPLC specific chromatogram of wild and cultivated C sinensis was established and four main nucleosides were simultaneously determined by the above method Specific chromatograms and contents of four main nucleosides showed no significant differences between cultivated and wild C sinensis These results can provide scientific evidences for further development and utilization of cultivated C sinensis.

[Key words]Cordyceps sinensis； wild； cultivated； specific chromatograms； nucleosides； HPLC

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis （BerK） Sacc寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要分布在我国青海、西藏、甘肃、云南和四川等高海拔地区，是传统的名贵中药材，在中国有悠久的药用历史，具有补肾益肺、止血化痰的功效[13]。近年来，冬虫夏草的人工繁育技术获得突破，为冬虫夏草野生资源稀缺可持续发展提供了一条途径[4]。核苷类成分是冬虫夏草的主要活性成分，具有明显的药理活性，《中国药典》以腺苷为含量测定指标[513]。冬虫夏草的核苷类成分研究较多，但野生品和人工繁育品之间的特征图谱和主要成分含量比较的研究较少。本文建立冬虫夏草野生品和人工繁育品的HPLC特征图谱，并进行相似度比较；同时测定尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷等4种主要核苷的含量，为冬虫夏草人工繁育品的进一步开发使用提供科学依据。

1材料

11仪器

1260型高效液相色谱仪（安捷伦公司），二极管阵列检测器（安捷伦公司），QUINTIX3131CN型1/1万电子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10万电子天平（Sartorius公司），KQ300DV型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司），MilliQ纯水仪（密理博公司）。

12试药

对照品尿苷（批号110887200202）、肌苷（批号140669201305）、鸟苷（批号111977201501）和腺苷（批号110879200202）由中国食品药品检定研究院提供；HPLCDAD（面积归一化法）检测纯度均大于980%。甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司），试验用水为超纯水。

13药材

野生冬虫夏草1～26采自于西藏自治区、青海省、四川省、甘肃省、云南省；冬虫夏草人工繁育品1～20）由广东东阳光药业有限公司提供；蛹虫草1～2采自广东省和天津市；发酵虫草菌粉（Cs4）1～2采自江西省；发酵冬虫夏草菌粉（CsCQ80）1～2采自浙江省。

實验样品均经中国食品药品检定研究院中药民族药检定所郑健研究员鉴定；冬虫夏草人工繁育品和野生品鉴定为麦角菌科真菌冬虫夏草菌C sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体；蛹虫草鉴定为麦角菌科真菌蛹虫草C militaris L Link的子实体；发酵虫草菌粉（Cs4）为麦角菌科真菌蝙蝠蛾拟青霉Paeailonyces hepialid Chen Cs4菌株，经生物工程液体深层发酵所得菌丝体的干燥粉末；发酵冬虫夏草菌粉为CsCQ80中华被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yuet Zeng （1989） 经液体深层发酵所得菌丝体的干燥粉末。endprint

2方法与结果

21溶液的制备

211混合对照品溶液的制备

取尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含尿苷、鸟苷、肌苷和腺苷分别为5025，4840，4675，2030 μg的对照品储备液。分别取对照品储备液适量，加水制成每1 mL含尿苷、鸟苷、肌苷和腺苷分别为5025，4840，4675，2030 μg的混合对照品溶液，即得。

212供试品溶液的制备

取本品粉末（过3号筛）约02 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水10 mL，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，20 ℃以下）30 min，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

23色谱条件与系统适用性

色谱柱Waters Xselect HSS T3 C18（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相水（A）乙腈（B）梯度洗脱（0～5 min，0% B；5～15 min，0%～10% B；15～30 min，10%～20% B；30～33 min，20%～50% B； 33～35 min，50%～0% B；35～40 min，0% B）；流速 06 mL·min-1；检测波长 260 nm；柱温 30 ℃。

24特征图谱

241冬虫夏草特征图谱的建立

取冬虫夏草野生品1～26和人工繁育品1～20粉末，精密称定，按22项方法制备供试品溶液，精密吸取5 μL，分别进样测定，记录40 min的HPLC色谱图，转换成AIA格式，采用导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012130723版本，下称“指纹图谱软件”）见图1，2。26批野生冬虫夏草的色谱图生成对照特征图谱见图3；以此野生冬虫夏草对照特征图谱为参照图谱计算野生品、人工繁育品、发酵虫草菌粉（Cs4）、发酵冬虫夏草菌粉（CsCQ80）及蛹虫草的相似度，结果见表1，2。

从下到上分别为对照特征图谱、野生冬虫夏草1～26。

从下到上分别为对照特征图谱，冬虫夏草人工繁育品1～20，发酵虫草菌粉，发酵冬虫夏草菌粉蛹虫草。

242特征峰的标定

根据26批冬虫夏草野生品的特征图谱检测结果，共标定12个特征峰。经过与对照品比对，可知5号峰为尿苷，7号峰为肌苷，8号峰为鸟苷，10号峰为腺苷；经文献分析，1号峰为尿嘧啶，2号峰为酪氨酸，3号峰为次黄嘌呤，4号峰为黄嘌呤，6号峰为2′去氧尿苷，9号峰为胸苷，11号峰为2′脱氧腺苷，12号峰为色氨酸。

243方法学考察

2431精密度试验精密吸取野生冬虫夏草1供试品溶液，按上述色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以腺苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<10%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD<20%，采用指纹图谱软件进行评价，相似度为099，结果表明仪器精密度良好。

2432稳定性试验精密吸取野生冬虫夏草1供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h，按3项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以腺苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<10%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD<20%，采用指纹图谱软件进行评价，相似度为099，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2433重复性试验精密吸取野生冬虫夏草1供试品溶液6份，精密称定，按22项方法分别制备供试品溶液，按3项色谱条件进样测定，记录色谱图。以腺苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD<2%，采用指纹图谱软件进行评价，相似度为099，结果表明，该方法重复性好。

244野生品和人工繁育品特征图谱比较

建立的HPLC特征图谱能够区别冬虫夏草及发酵虫草菌粉（Cs4）、发酵冬虫夏草菌粉（CsCQ80）和蛹虫草。与对照特征图谱相比，发酵虫草菌粉（Cs4）的相似度为084～086，发酵冬虫夏草菌粉（CsCQ80）為075～076，蛹虫草为079～080，三者相似度均小于09。而46批冬虫夏草的相似度均在09以上，26批野生冬虫夏草的相似度在091以上，20批冬虫夏草人工繁育品的相似度均在094以上。冬虫夏草人工繁育品与野生冬虫夏草的特征图谱基本一致。

25含量测定

251系统适用性试验

按3项色谱条件进行检测，尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷4种成分分离度大于15，理论塔板数大于1万，色谱图见图4。

252方法学考察

2521线性关系考察精密吸取各对照品储备液01，02，05，10，20 mL分别置于5个10 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀各系列浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取上述混合对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度（mg·L-1）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表3，表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。

2522精密度试验精密吸取21项混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的峰面积的RSD分别为036%，029%，045%，048%（n=6），表明仪器精密度良好。

A 混合对照品溶液；B 野生品 ；C 人工繁育品；5尿苷； 7肌苷；8鸟苷；10腺苷。

2523重复性试验取样品粉末（野生品1）6份，分别按照22项方法制备供试品溶液，按3项色谱方法测定，记录峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液的尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的测定结果RSD（n=6）分别为089%，096%，078%，12%，结果表明重复性良好。endprint

2524溶液稳定性试验取同一份供试品溶液（野生品1），分别于0，2，4，8，12 h进样测定。结果尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的峰面积的RSD（n=6）分别为038%，035%，079%，091%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2525加样回收试验取已知含量的1号冬虫夏草野生品粉末6份，每份约01 g，置具塞锥形瓶中，精密加入各對照品溶液（尿苷2010 mg·L-1、肌苷1936 mg·L-1、鸟苷935 mg·L-1和腺苷7105 mg·L-1）各1 mL，分别按照22项方法制备供试品溶液，按3项色谱方法测定，记录峰面积，计算回收率结果尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷平均加样回收率（n=6）分别为1016%，1025%，1023%，9860%，RSD分别为17%，15%，13%，17%。

2526样品含量测定分别取野生冬虫夏草和人工繁育品，按22项方法制备供试品溶液，再按3项色谱条件进行测定，用外标法计算样品含量，结果见表4。

3讨论

31色谱条件的选择

本文采用梯度洗脱法分离冬虫夏草药材中的4种主要核苷类成分，40 min内完成分离，尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷分离效果良好，符合含量测定要求。本文通过二极管阵列检测器考察所测物质紫外吸收，4种成分均为260 nm，故选择260 nm作为检测波长。流动相选择乙腈水系统，以纯水为起始溶剂梯度洗脱各色谱峰均实现基线分离，能够达到定量要求。

32提取条件的选择

冬虫夏草服用时多以水提取，加上核苷类成分极性大、水溶性好，流动性以纯水为起始梯度，提取溶剂中存在有机相容易导致色谱图鼓包，本试验选择以纯水为溶剂制备供试品溶液。由于部分核苷类成分热稳定性差，超声提取时加冰块以避免核苷分解。

33含量测定结果分析

采用SPSS 190软件处理20批冬虫夏草人工繁育品和26批野生冬虫夏草的4种主要核苷（尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷）的含量测定结果。冬虫夏草人工繁育品和野生品2个样本组，经独立样本t检验显示无显著性差异；通过主成分分析，结果见图5，2组样本之间分布均匀，结果显示野生品和人工繁育品2组之间4种主要核苷含量均无显著性差异。

本研究建立冬虫夏草野生品和人工繁育品的特

征图谱，并同时测定4种主要核苷类成分，并进行了比较分析，为冬虫夏草药材质量综合评价提供了科学依据。冬虫夏草人工繁育品和野生品核苷类成分

基本一致，其他类型化学成分以及药理活性尚需进一步研究。

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[责任编辑丁广治]endprint