青稞核糖体蛋白基因HbRPL11的克隆、序列分析及原核表达

王玉林

摘 要：【目的】为了进一步明确青稞核糖体蛋白基因HbRPL11的功能【方法】根据鉴定得到的青稞核糖体蛋白基因HbRPL11的序列设计了引物，从青稞幼嫩叶片的cDNA中得到目的片段，并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析，同时构建了原核表达载体pET28a（+）-RPL11，转化入大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG 诱导外源蛋白质表达并利用SDS-PAGE凝胶电泳检测。【结果】成功扩增出了青稞核糖体蛋白基因HbRPL11的CDS全长序列，得到了重组蛋白。【结论】青稞核糖体蛋白基因HbRPL11的CDS全长序列大小为543 bp。经生物信息学分析，HbRPL11编码的蛋白质含有181个氨基酸，相对分子质量为24KD，理论等电点（pI）为5.17，总平均亲水性（GRAVY）为0.766，不稳定系数为37.67为稳定蛋白。重建蛋白质三维结构表明该蛋白包含14个β-片状螺旋结构存在典型的核糖体蛋白L5结构域。系统进化分析表明，HbRPL11与小麦和山羊草的RPL11具有较近的亲缘关系。蛋白表达结果显示，重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。

关键词：青稞；核糖体蛋白；RPL11；序列分析；原核表达

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum HooK.f.）为禾本科大麦属，又名裸大麦、米大麦，为藏族人民主要粮食作物，是高原特色农作物之一，有独特的营养结构和保健作用。青藏高原环境条件极端：高寒缺氧， 环境恶劣， 降雨量少、蒸发量大，青稞是在这种极端环境下植物适应性进化的典型代表。近些年来，研究者们先后对青稞的抗盐性[2， 3]、抗旱性[4， 5]等方面进行了研究，为选育适应性强、综合性状优良的品种奠定基础。

我们通过转录组测序和抑制性差減杂交技术对青稞的抗寒相关基因进行了筛选，发现了核糖体蛋白基因RPL11（GeneBank登录号： AK249873.1）。核糖体蛋白主要有70S和80S两种类型[6， 7]，RPL11是叶绿体50S大亚基中编码核糖体蛋白L11基因的序列。近期研究发现，核糖体蛋白不仅具有组成核糖体参与蛋白质合成的功能，还可通过参与复制、转录、RNA加工、DNA修复等进程调节细胞的分裂、增殖、分化、发育等多种生命活动。我们以青稞为材料，进行RPL11基因的克隆、序列分析及原核表达，旨在为进一步了解RPL11功能，明确该蛋白与抗寒相关性方面提供参考依据，并为青稞的资源有效保护与利用提供科学依据。

一、材料与方法

1.材料

供试材料为西藏自治区农牧科学院提供的青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）‘320和‘喜马拉雅8号种子。

2.方法

（1）青稞种苗转录本的提取及反转录。将适量的青稞种子播种于富含有机质的盆栽土壤中，正常浇水管理，待植株生长正常，以青稞新鲜幼叶为材料，使用Scientz-48高通量组织研磨仪磨样，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit试剂盒提取新鲜叶片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit进行反转录，cDNA样本与-20℃冷冻保存。

（2） HbRPL11基因的克隆。依据转录组测序分析结果，利用Primer Premier 5.0 软件设计特异引物RPL11-F：5′- ATGTGCGGATCCATGTCGACGGAGAAG -3′，RPL11-R：5′- ATGTCGCTCGAGTTAGCTCGCATGGGACT -3′。RT-PCR反应于S-1000 Thermal Cycler仪器，反应体系采用20 μL PCR获得充足产物：TaqDNA聚合酶（TaKaRa，5 U/μL） 0.2μL，10×PCR反应缓冲液（Takara） 2μL，dNTP（10 mmol/L）1.6μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 2μL，灭菌水12.6μL。反应条件：：94℃预变性 3 min；94 ℃变性 45 s，64 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 60 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。回收目标片段，克隆、测序。

（3）HbRPL11基因的生物信息学分析。利用NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）、ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）、DISPHOS（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）、InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）、Conserved domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal IP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TargetP 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、PredictProtein（https：//ppopen.rostlab.org/）、NPS（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopm.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）等网络资源对HbRPL11进行序列分析。根据推测的HbRPL11氨基酸序列，利用MEGA5.1软件进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。

（4）原核表达载体的构建及转化。挑选测序正确的阳性克隆使用碱裂解法提取质粒，采用EcoR I和Hind III分别双酶切阳性重组质粒和表达质粒pET-28a（+），1%琼脂糖凝胶回收目标片段，使用T4 DNA连接酶在16℃条件下过夜进行片段连接。挑取单克隆，37℃震荡培养后提取质粒，酶切鉴定阳性重组质粒。将鉴定正确的阳性质粒pET28a-RPL11热激转化至表达宿主菌BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞。将提取的pET-28a（+）空载体转化表达宿主菌BL21（DE3）作阳性对照，BL21（DE3）感受态细胞不转化组作阴性对照。endprint