慢性间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化

郑恬恬 王小琴

慢性间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化

郑恬恬 王小琴

目的探讨间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化。方法将32 只6 周龄雄性SD大鼠随机分成4 组(n=8):常氧对照组(A组)、常氧牙周炎组(B组)、间歇性低氧组(C组)、间歇性低氧合并牙周炎组(D组)。用正畸结扎丝结扎双侧上颌第二磨牙颈部和高糖饮食方法建立牙周炎模型，常氧和低氧组分别在常氧和模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征条件下饲养8 周，采集大鼠实验牙龈沟液标本，实时荧光定量PCR方法检测牙龈卟啉单胞菌的变化。结果所有的大鼠均检出牙龈卟啉单胞菌。D组牙龈卟啉单胞菌的量明显高于其他3 组(P<0.05)； B组牙龈卟啉单胞菌的量高于A组(P<0.05)。结论慢性间歇性低氧可加重牙周炎病程，与龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的增加有关。

慢性间歇性低氧; 牙周炎; 牙龈卟啉单胞菌; 实时荧光定量PCR

阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)指睡觉期间上呼吸道周期性地部分或全部塌陷，导致呼吸暂停、低通气、睡觉中断等[1]。慢性牙周炎(CP)主要由革兰氏阴性杆菌引起的牙周支持组织的慢性炎症[2]。研究表明OSAHS和CP有着共同的危险因素：如年龄、性别、肥胖、吸烟、喝酒、糖尿病和口呼吸等[3-4]。越来越多研究表明OSAHS是心脑血管疾病的独立危险因素，包括高血压、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律失常和脑中风[1]。同样，已有学者证明牙周致病菌能够进入血液循环，从而导致全身系统性疾病，如冠心病、动脉粥样硬化等[4]。这两种疾病可能存在潜在的共同发病机制，已有证据表明OSAHS患者CP的发病率明显增高[5-7]，但两者潜在的发病机制尚不明确。牙龈卟啉单胞菌(Pg)是目前公认的牙周炎主要致病菌之一，有关Pg在两者关系中的作用目前尚未见报道。本实验通过建立模拟OSAHS的间歇低氧条件下的大鼠牙周炎模型[8-9]，用实时荧光定量PCR方法检测Pg的变化，从微生物角度来探讨OSAHS和CP之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和仪器

清洁级6 周龄健康雄性SD大鼠32 只(山西医科大学动物实验中心提供);间歇性低氧舱(太原市有机玻璃厂);15号吸潮纸尖(北京达雅鼎医疗器械公司)；微量样品基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR Master Mix (中科瑞泰生物科技有限公司)；PCR仪(杭州搏日科技有限公司);DNA凝胶回收试剂盒、小剂量快速质粒DNA提取试剂盒(Omega公司,美国)；pEASY-T5 Zero Cloning Kit(含DH5α感受态细胞)(北京全式金试剂有限公司)；2× SYBR Green qPCR Master Mix(biotool.com)荧光定量PCR仪(7500型,ABI公司,美国)。

1.2 动物分组及建模

1.2.1 实验动物分组 32 只雄性大鼠，体重约200 g，随机分成4组，常氧对照组(A组)、常氧牙周炎组(B组)、间歇性低氧组(C组)、间歇性低氧合并牙周炎组(D组)，每组8 只。

1.2.2 各组动物模型建立 A组：正常氧环境，常规饲料喂养; B组：10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，用0.2 mm正畸结扎丝结扎于双侧上颌第二磨牙牙颈部，高糖饮食(100 g饲料中含56 g蔗糖，28 g全脂奶粉， 6 g全麦粉, 4 g酵母粉， 1 g肝粉， 2 g食盐，3 g新鲜蔬菜)，正常氧环境; C组：动物放入低氧舱内(用氧浓度监测仪在低氧舱里进行实时监控，保持低氧舱内氧浓度为9%～21%。低氧舱设置：通氮气70 s，缺氧25 s， 通氧气25 s， 2 min为一个循环，如此反复)模拟OSAHS患者缺氧环境，每日间歇缺氧8 h。常规饲料喂养; D组：牙周处理同B组，缺氧条件同C组。

1.3 样本采集

大鼠饲养8 周时，麻醉下固定，用无菌刮匙去除每只大鼠右上第二磨牙颊侧龈上菌斑，无菌棉球隔湿，干燥，用15号灭菌吸潮纸尖直接插入牙周袋底，静置30 s， 纸尖立即置入1.5 ml EP管中，PBS缓冲液200 μl， -20 ℃冻存待用。

1.4 用实时荧光定量PCR的方法检测Pg的变化

1.4.1 提取目的DNA 取A组一个样本，按照微量样品基因组DNA提取试剂盒说明操作,提取DNA。

1.4.2 引物的设计 参考文献[8]，Pg的特异性引物，根据细菌16Sr RNA基因特异保守区域设计，由北京擎科新业生物技术有限公司合成(表 1)。

表 1 Pg引物序列及相关信息

1.4.3 荧光定量PCR标准曲线的制备Pg部分基因片段的扩增: PCR反应体系为：2×Master Mix: 10 μl，上游引物：0.8 μl，下游引物：0.8 μl， DNA模板：2 μl， 水：补足至20 μl。PCR反应程序为：预变性94 ℃ 5 min， 变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 25 s， 35 个循环，循环结束后，延伸72 ℃ 5 min， 4 ℃保存，反应结束后，将扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，由北京金诺锐杰基因科技有限公司进行测序。

连接转化: 按照凝胶回收试剂盒说明操作对 PCR产物纯化回收。纯化产物与载体连接，在微型离心管中依次加入纯化回收的目的DNA片段4 μl、 pEASY-T5 Zero Cloning Vector 1 μl，轻轻混合，室温反应5 min。反应结束后，将离心管置于冰上。加连接产物于50 μl Trans1-T1感受态细胞中，冰浴25 min， 42 ℃热激30 s， 冰浴2 min， 加250 μl LB液体培养基200 r/min、 37 ℃孵育1 h，取200 μl菌液铺板，培养过夜后，挑取单菌落白斑，放入50 ml LB液体培养基， 37 ℃， 200 r/min振荡培养过夜。

质粒提取及浓度测定: 重组质粒测序成功后，使用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，核酸蛋白浓度测定仪测定其浓度和纯度，浓度为376.2 ng/μl。 利用以下公式计算质粒拷贝数：(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/DNA长度 ×660=拷贝数/μl，得7.876×1010拷贝数/μl。

标准曲线的建立: 将质粒标准品连续10 倍稀释至103～1010拷贝/μl，作为模板，进行荧光定量PCR建立标准曲线。反应体系如下：2×Biotool SYBR Green Master Mix(LowRox)10 μl, Template 100 ng, Forward Primer 1 μl, Reverse Primer 1 μl, Distilled Water(dH2O) Addto M 20 μl。

按照如下参数设置反应：95 ℃ 5 min一个循环； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s进行40 个循环；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s，进行1 个循环。根据荧光值的变化规律，系统自动生成标准曲线和溶解曲线。

1.4.4 荧光绝对定量PCR测定样品中Pg的量 依照上述反应体系将样品提取的DNA与标准品同时进行荧光定量PCR，通过标准曲线得出样品中Pg的拷贝数。

1.5 统计学分析

应用SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，多个样本间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因部分片段扩增产物的鉴定结果

采用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因克隆产物结果如图 1所示。 从图中可以看出， 3 个目的基因泳道只有1 条亮带，通过与DNAMaker 对比得知，目的基因扩增产物大小与预期产物片段大小相符合，无非特异条带产生，所得扩增产物为特异性目的片段。

Pg测序结果显示，与NCBI公布的已知序列相似度为100%，测序结果比对图 2。

M： DNA标志; 1-3：Pg目的DNA片段; 4： 空白对照

图 1PgPCR扩增产物电泳图

M： DNA Maker； 1-3： Target DNA； 4： Blank control

Fig 1PgPCR amplification product electrophoresis

图 2 测序结果

2.2 目的基因绝对定量标准曲线和溶解曲线

质粒标准品经过实时荧光定量PCR，根据质粒浓度梯度与Ct值之间的关系，系统输出标准曲线和溶解曲线。溶解曲线如图 3，表现为单一的峰，说明扩增过程中没有非特异性产物。如图 4标准曲线能反映未知样品的拷贝数。

所有的大鼠均能检出Pg， 检出量如表 2。 D组Pg的量明显高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)； B组的Pg量高于A组, 差异有统计学意义(P<0.05)。

图 3 溶解曲线

图 4 Pg标准曲线

Tab 2 Pg detectable quantity(copies/μl, ±s)

注： ④与①、②、③相比，P<0.05; ③与②相比，P<0.05; ①与②相比，P<0.05

3 讨 论

慢性牙周炎是细菌引起的牙周组织的感染性疾病。许多证据表明OSAHS和CP是有关系的[3-7]，但是也有研究表明OSAHS和CP关系的证据不充分，OSAHS和CP之间的因果关系值得讨论，有待进一步研究[5]。而Pg是牙周病，尤其是慢性牙周炎病变区域或活动部位最主要的优势菌，其存在与牙周炎治疗后复发或病情加重有关。本实验模拟OSAHS的间歇低氧条件下的大鼠牙周炎模型，从微生物角度来探讨OSAHS和CP之间的关系。

龈下菌斑样本采集方法是影响微生物检测结果的重要因素之一。目前大多数学者主要采用纸尖法或刮匙法采集龈下菌斑，2 种方法各有优缺点。纸尖法，操作容易简单，相对可以标准化，主要采集的是龈下非附着区菌斑，且对龈下微生态环境影响较小，重复性好；但难到达牙周袋底部，并且纸尖表面积较小，所采集到的菌斑量有限。刮匙法可到达牙周袋底部，并且采集菌斑量较多，但此法采集到的主要是龈下根面 附着区菌斑；且此法对龈下微生态系统的干扰较大。研究表明纸尖法和刮匙法均为较准确的方法[10]。综合2 种方法的优缺点，本实验采用纸尖法。

细菌定量检测的方法很多，如细菌培养、DNA探针等，但这些方法都有一定局限性。如细菌培养法敏感性低，计数结果不精确，而Pg属于难培养的革兰阴性厌氧菌，培养鉴定极为困难。实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一项定量分析技术，具有反应迅速，精确性高，敏感性强，是应用于牙周领域相关研究的重要手段[11]。

本实验D组Pg的量明显高于其他各组，差异有统计学意义；B组Pg的量高于A组,差异有统计学意义。与罗丽 等[12]学者模拟高原缺氧环境对家兔慢性牙周炎龈下菌群种类分布得出一致结论。本实验得出结论OSAHS和CP有一定的关系，这可能与低氧状态下Pg等致病菌的增殖有关。

[1] Nizam N,Basoglu OK,Tasbakan MS，et al. Salivary cytokines and the association between obstructive sleep apnea syndrome and periodontal disease[J]. J Periodontol, 2014, 85(7): e251-e258.

[2] Haffajee AD, Socransky SS. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases[J]. Periodontol 2000, 1994, 5: 78-111.

[3] Ahmad NE, Sanders AE, Sheats R, et al. Obstructive sleep apnea in association with periodontitis: A case-control study[J]. J Dent Hyg, 2013, 87(4): 188-199.

[4] Al-Jewair TS, Al-Jasser R2, Almas K. Periodontitis and obstructive sleep apnea's bidirectional relationship: a systematic review and meta-analysis[J]. Sleep Breath, 2015, 19(4): 1111-1120.

[5] Gunaratnam K, Taylor B, Curtis B, et al. Obstructive sleep apnoea and periodontitis: A novel association?[J]. Sleep Breath, 2009, 13(3): 233-239.

[6] Keller JJ, Wu CS, Chen YH, et al. Association between obstructive sleep apnoea and chronic periodontitis: A population-based study[J]. J Clin Periodontol, 2013, 40(2): 111-117.

[7] Seo WH, Cho ER, Thomas RJ, et al. The association between periodontitis and obstructive sleep apnea: A preliminary study[J]. J Periodontal Res, 2013, 48(4): 500-506.

[8] 罗荧荃, 黄国庆, 杨宇. 慢性间歇低氧诱发大鼠高血压模型的建立[J]. 中国新药杂志, 2006, 15(22):1930-1933.

[9] 吴亚菲, 赵筱芩, 陈宇， 等. 不同方法建立大鼠实验性牙周炎模型的比较研究[J]. 四川大学学报(医学版)，2003, 34(4): 742-745.

[10]王丽， 杨禾， 吴亚菲. 纸尖法和刮匙法对龈下牙周致病菌检出比较研究[J]. 临床口腔医学杂志， 2008， 24(12)： 707-710.

[11]王丽， 杨禾， 吴亚菲. 实时荧光定量聚合酶链反应技术在牙周相关研究中的应用[J]. 国际口腔医学杂志, 2008, 35(S1): 117-119.

[12]罗丽. 模拟高原缺氧环境对家兔慢性牙周炎龈下菌群种类分布的影响[D]. 重庆： 第三军医大学, 2012.

ThechangeofPorphyromonasgingivalisinratgingivalcrivicularfluidunderchronicintermittenthypoxia

ZHENGTiantian1,WANGXiaoqin2.

1. 030000Taiyuan，ShanxiMedicalUniversity,China； 2.TheFirstClinicalHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan

Objective: To study the change ofPorphyromonasgingivalis(P.gingivalis) in rat gingival crivicular fluid(GCF) under chronic intermittent hypoxia.Methods32 male SD rats were randomly divided into 4 groups(n=8): normoxia control group(A), normoxia with periodontitis group(B), intermittent hypoxia group(C), and intermittent hypoxia with periodontitis(D). Periodontitis model was established by orthodontic silk ligation at the maxillary second molar neck and high sugar diet. The rats in normoxia and hypoxia group were raised respectively under the condition of ordinary oxygen and chronic intermittent hypoxia respectively. After 8 weeks, GCF of the target teeth was collected,P.gingivaliswas quantified by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsP.gingivaliswas detected in all groups.P.gingivalisin group D was more than in other groups(P<0.05); meanwhile,P.gingivalisin group B was more than in group A(P<0.05).ConclusionChronic intermittent hypoxia can aggravate the severity of periodontitis, which is associated with the increase ofP.gingivalisin GCF.

Chronicintermittenthypoxia;Periodontitis;Porphyromonasgingivalis;Real-timePCR

山西省自然科学基金(编号： 2014011046-2)

030000 太原， 山西医科大学(郑恬恬)； 山西医科大学第一临床医院(王小琴)

王小琴 E-mail： wangxiaoqin2009@yeah.net

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.002

(收稿： 2016-11-12 修回： 2017-03-25)