不同温度艾灸对高脂血症大鼠血脂及背根神经节瞬时感受器电位香草酸受体1 mRNA表达的影响

王桂英+王耀帅+高建芸+苏方方+陈若暘

摘要：目的 观察不同温度艾灸热刺激对高脂血症大鼠血脂及背根神经节瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1）mRNA表达的影响，验证艾灸调脂疗效与激活TRPV1相关。方法 采用高脂饲料喂养制作高脂血症大鼠模型。将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、38 ℃艾灸组和45 ℃艾灸组，每组15只。38 ℃艾灸组和45 ℃艾灸组均取“神阙”和双侧“足三里”，每穴艾灸10 min/次，隔日1次，连续4周。干预结束后取血，氧化酶法检测血清胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇含量；取背根神经节组织，实时荧光定量PCR检测TRPV1 mRNA表达。结果 与模型组比较，艾灸组血脂指标均得到不同程度的调整，45 ℃艾灸组差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且45 ℃艾灸组与38 ℃艾灸组比较差异有统计学意义（P<0.01）；45 ℃艾灸组较其他3组背根神经节TRPV1 mRNA表达差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 艾灸调脂疗效与艾灸激活TRPV1相关。

关键词：灸温；瞬时感受器电位香草酸受体1；血脂；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.011

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0044-04

Abstract： Objective To compare the effects of moxibustion at different temperatures on blood lipid and TRPV1 in dorsal root ganglion with hyperlipidemia rats； To verify the correlation between efficacy of adjusting fat of moxibustion with activating of TRPV1. Methods The rat model of hyperlipidemia was made by high fat diet. 60 SD mice were randomly divided into four groups： control group， model control group， the 38 ℃ moxibustion group and the 45 ℃ moxibustion group， with 15 mice in each group. Acupoints Shenque and Zusanli were chosen under moxibustion for 10 minutes each time， once another day， for 4 weeks， in the 38 ℃ moxibustion group and the 45 ℃ moxibustion group. Blood was taken after intervention， and blood TC， TG， LDL-C and HDL-C of the mice were detected by oxidase method； the dorsal root ganglion was taken to detect the expression of TRPV1 mRNA by real-time fluorescence quantitative PCR. Results Compared with model group， blood lipid indexes in moxibustion groups had different changes， with statistical significance compared with 45 ℃ moxibustion group （P<0.05， P<0.01）， and there was statistical significance between 38 ℃ moxibustion group and 45 ℃ moxibustion group （P<0.01）； there was statistical significance in TRPV1 mRNA of dorsal root ganglion among 45 ℃ moxibustion group and other three groups （P<0.01）. Conclusion The correlation between efficacy of adjusting fat of moxibustion with activating of TRPV1 has been confirmed.

Key words： moxibustion temperature； TRPV1； blood lipid； rats

基金項目：国家自然科学基金（81603695、81503648）

艾灸临床疗效有针刺治疗所不及的优势。《灵枢·官能》云：“针所不为，灸之所宜。”吴焕淦等[1]认为，以灸法临床有效的病症为载体，开展基于临床灸法作用机理研究，阐明艾灸作用特点及机理，有利于灸法研究的新发展。课题组前期研究发现，不同温度艾灸热刺激对急性高脂血症模型小鼠胆固醇调整有差异[2]，为了研究艾灸调整其他血脂组分的普遍意义及与瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1）相关性，本实验仍以临床灸法的有效病种高脂血症为载体，选用慢性高脂血症模型大鼠，以不同温度（38 ℃和45 ℃）作为实验的干预条件，观察不同温度艾灸对高脂血症大鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的影响及艾灸后大鼠背根神经节TRPV1 mRNA表达的差异，以期为艾灸的效应机制与TRPV1通道蛋白的普遍相关性研究提供实验依据。endprint

1 实验材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只，4周龄，体质量（100±20）g，上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养于东南大学医学院清洁级实验动物中心，温度24～26 ℃，相对湿度45%～55%，光照12 h/12 h明暗交替，自由摄食饮水。高脂饲料（酪蛋白、蔗糖、玉米淀粉等），北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2 仪器

直径7 mm动物用清艾灸条（南阳汉医艾绒有限责任公司），温度测量仪（HC-04型，杭州洪昌科技有限公司），荧光定量PCR循环仪（中山达安基因股份有限公司，DA7600），核酸电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6B），手术显微光镜（上海医光仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模及分组

参考文献[3]方法，采用高脂饲料喂养，结合预实验进行造模，自由进食高脂饲料，喂养8周，次日晨空腹抽血，检测血脂4项，判定造模成功与否。实验大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、38 ℃艾灸组、45 ℃艾灸组，每组15只。

2.2 控温预实验

保持室温26 ℃，将SD大鼠穴位区1 cm×2 cm鼠毛剃除，暴露局部皮肤，酒精棉球消毒。用自制固定袋仰卧位固定大鼠，待大鼠安静后进行艾灸，将温度测量仪探头置于施灸穴位皮肤表面以检测实时温度，将艾条吹至红火状态，靠近穴位皮肤，当温度检测达到理想温度后稍抬高艾条，继续施灸，当温度下降时降低艾条，控温过程中及时弹艾灰、吹艾条，持续稳定控制温度，上下波动不超过1 ℃，测量艾条与艾灸穴位皮肤的垂直距离。预实验结果：38 ℃艾灸组施灸温度控制在（38±1）℃，艾条距离穴位皮肤（35±5）mm；45 ℃艾灸组施灸温度控制在（45±1）℃，艾条距离穴位皮肤（10±2）mm。

2.3 干预方法

成模后当日进行干预，保持室温26 ℃，将SD大鼠穴位区1 cm×2 cm鼠毛剃除，暴露局部皮肤，酒精消毒。用自制固定袋仰卧位固定大鼠，待大鼠安静后进行艾灸。采用控温预实验方法进行不同温度施灸，将温度控制仪探头置于施灸穴位皮肤表面以检测实时温度，通过调节艾条与穴位皮肤的距离，吹艾火、弹艾灰频率控制温度。38 ℃艾灸组施灸温度控制在（38±1）℃，45 ℃艾灸组施灸温度控制在（45±1）℃。2组均施灸“神阙”“足三里”（双侧），每穴每次10 min，隔日治疗1次，连续治疗4周。正常组只做抓取固定，隔日1次。

2.4 指标检测

2.4.1 血脂 治疗结束后，所有实验大鼠迅速眼眶取血，3500 r/min離心10 min，取上清液置于0.5 mL EP管中，氧化酶法检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.4.2 瞬时感受器电位香草酸受体1 mRNA表达 所有实验大鼠迅速放血处死后，即刻沿脊柱剪开背部皮肤，在冰浴上分离脊柱，沿脊髓腹侧面剪开椎管，剪断并剥离神经纤维，在手术显微光镜下使用显微镊从锥孔中取出腰段背根神经节，清除残余神经纤维，将背根神经节放入冻存管，液氮保存。先进行RNA提取，再测定其纯度和浓度，质量测定后，进行cDNA第一链合成，反转录cDNA进行预实验，再行RT-qPCR实验，每个样本基因设3个复孔，反应体系：2×Real time PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL，模板（cDNA稀释10倍）1 μL，引物Mix（F/R各为10 μmol/L）2 μL，DEPC水7 μL，20 μL。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用完全随机设计方差分析，组间两两比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 不同温度艾灸热刺激对模型大鼠血脂指标的影响

与正常组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C变化差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，艾灸组血脂各项指标均有调整，但仅45 ℃艾灸组血脂各项指标差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且45 ℃艾灸组与38 ℃艾灸组各项血脂指标比较差异也有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。

4.2 不同温度艾灸热刺激对模型大鼠背根神经节瞬时感受器电位香草酸受体1 mRNA表达的影响

各组TRPV1 mRNA相对表达量两两比较，45 ℃艾灸组与其他3组比较差异均有统计学意义（P<0.01），见图1。

5 讨论

高脂血症的基本病机，清代医家张志聪注解《内经》时较完整的叙述为：中焦之气蒸津液化其精微，发泄于腠理，淖泽注于骨，补益髓脑，润泽皮肤，是津液注于三百六十五节而渗灌于皮肤肌腠者也。溢于外则皮肉膏肥，余于内则膏脂丰满。高脂血症的治疗，西医主要以调脂药物为主，针灸治疗高脂血症疗效肯定。刘志诚[4]认为，针灸调脂机制在于调整与脂质代谢相关的多种酶的功能，增强其活性，使血脂各项水平被很快代谢，促进肝肠循环，而降低血脂含量。本课题组前期临床研究已经证实，温灸对高脂血症患者有良好的调脂作用，且艾灸温度是影响艾灸调脂疗效的决定性因素之一，不同灸温调脂疗效有差异[5-6]。本实验结果显示，45 ℃艾灸组干预TC、TG、LDL-C、HDL-C效应明显优于38 ℃艾灸组，同样表明温度是影响灸法疗效的重要因素。

关于灸法的作用机制研究，《灵枢·刺节真邪》有“火气已通，血脉乃行”，《外台秘要》有“火气不行，不能除病也”。古代医家认为艾灸疗效的实现以“火气已通”为标志，“火气已通”必须要有一定强度的温热刺激。王冰注：“火艾烧灼，谓之灸焫。”强调烧灼是艾灸的关键技术。有学者指出，艾火的刺激造就了灸法疏通气血的效应特征，温热刺激是艾灸的主要刺激，是艾灸效应产生的主要影响因素，也是艾灸温通作用机制的基础[7]。endprint

近年来很多针灸实验研究也关注施灸温度与效应的关系，认为不同施灸温度产生的效应不一样。李亮等[8]发现，温度达46 ℃以上，热刺激面积与大鼠延髓背侧网状亚核神经元的放电活动呈线性相关。Wang Y SH等[9]研究发现，46 ℃艾灸热刺激比38 ℃艾灸热刺激对大鼠心血管功能的影响更有意义。周攀等[10]研究发现，施灸温度不同，抗炎效果也有差异。

艾灸疗法是通过对穴位局部皮肤的温热刺激发挥治疗作用的，现代神经生物学研究发现躯体及皮肤组织中分布有感受不同温度范围的蛋白受体TRP。TRP亚家族成员之一TRPV1又被称为辣椒素受体，是热控离子通道，它能调节小直径的神经元对适度热刺激反应，43 ℃热刺激能直接激活TRPV1，它可能是热痛感受器的分子结构基础。还有研究发现TRPV1通道在小鼠的热刺激感受中可能起主要作用[11]。

本实验研究不同温度艾灸的效应及与TRPV1的相关性，设定2组温度要分别高于和低于TRPV1的激活温度43 ℃，且具有实验可行性。课题组前期研究表明，温、热、灼、痛4种不同灸感对应的温度范围有别，“温”的温度范围大概在32.8～35.8 ℃，“热”的温度范围大概在36.8～39.9 ℃，“灼”的温度范围大概在40.9～43.5 ℃，“痛”的温度≥44.5 ℃。高于45 ℃大部分人表现为难以忍受的灸痛。温度感受个体差异很大，38 ℃低于43 ℃，接近于体温，人体感觉舒适；45 ℃高于43 ℃，艾灸时有明显灼热痛感，但能忍受[12]。因此，我们选用这2种温度作为干预条件。

实验结果显示，45 ℃艾灸组较38 ℃艾灸组背根神经节组织TRPV1 mRNA表达明显升高，这与调脂结果相一致。说明TRPV1是艾灸效应的重要的分子靶点，艾灸调脂效应启动机制与激活TRPV1相关，至于激活TRPV1后的相关生物化学反应，及与TRP家族其他成员尤其是TRPV3的联系，尚不明确，亟待深入研究。

艾灸主要是温热刺激，患者有灼热感。艾灸对机体的有效刺激应该具有一定的温度阈值范围，即适宜的艾灸温热刺激，艾灸临床适宜的温度可能是高于TRPV1热刺激温度43 ℃，且患者能够承受的温度，至于怎样的温度合适，是否有个体和病种及穴位差异，还需进一步临床验证。

参考文献：

[1] 吴焕淦，马晓芃，刘慧荣，等.灸法研究的战略思考[J].世界科学技术-中医药现代化，2016，18（3）：355-360.

[2] 王桂英，王耀帅，卢开信，等.不同灸温对高脂血症小鼠胆固醇及神阙穴皮肤的影响[J].中国针灸，2016，36（1）：59-63.

[3] 徐叔云.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002：1203.

[4] 刘志诚.肥胖病的针灸治疗[M].北京：人民卫生出版社，2008：64.

[5] 高建芸，王桂英，王玲玲.TRPV1介导不同温度艾灸调脂通脉效应的临床研究[J].时珍国医国药，2015，26（9）：2182-2184.

[6] 张会芳，王玲玲，张建斌，等.艾灸温通调脂临床研究[J].世界中医药， 2013，8（8）：871-879.

[7] 王玲玲.艾灸的特点及温通效应[J].中国针灸，2011，31（10）：865- 868.

[8] 李亮，杨金生，荣培晶，等.不同表面积和不同温度的热灸样刺激对大鼠延髓背侧网状亚核神经元的激活作用[J].针刺研究，2011，36（5）：313-320.

[9] WANG Y SH， ZHANG J B， JIANG J F， et al. Research on effects of the thermal stimulation by moxibustion at different temperatures on cardiac function in rats and on mast cells in the local site of moxibustion[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine，2013，2013：ID545707.

[10] 周攀，張建斌，王玲玲，等.不同灸温的艾灸抗炎效应及TRPV1作用机制研究[J].中国中医基础医学杂志，2015，21（9）：1143-1145.

[11] HUANG S M， LI X， YU Y， et al. TRPV 3 and TRPV 4 ion channels are not major contributors to mouse heat sensation[J]. Mol Pain， 2011，7：37.

[12] 张会芳.不同灸温调脂通脉效应以及TRPV1介导灸法“以温促通”效应机制研究[D].南京：南京中医药大学，2013.endprint