骨髓间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

2017-11-13 23:22陈丽燕邓丽青陈金花钟郁刘佳
中国科技纵横 2017年19期
关键词:间充质干细胞骨髓培养

陈丽燕++邓丽青++陈金花++钟郁++刘佳

摘 要:为优化骨髓间充质干细胞的分离和培养方法,采用改良的骨髓冲洗法分离骨髓干细胞,细胞接种后,比较不同体积分数胎牛血清(5%,10%,20%)、不同的DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM培养基,进行细胞培养,比较细胞生命状态。结果显示不使用筛网细胞分离细胞,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12M培养基培养,能够提高培养效率。

关键词:间充质干细胞;骨髓;培养

中图分类号:R329 文献标识码:A 文章编号:1671-2064(2017)19-0200-02

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs)是指存在于骨髓基质中的非造血组织的间充质干细胞,在体内分布于多种组织和器官,并具有多向分化潜能。它有着广泛的来源,包括骨髓,骨骼肌,软骨,骨,肌腱等[1]。故在干细胞研究领域中具有突出的优势。本实验对小鼠BMSCs的生物学性进行研究,旨在建立体外分离培养BMSCs的方法,培养出生长状态良好,足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提,进一步为组织工程、细胞治疗和基因治疗研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物:6-8周龄SPF级昆明小鼠20只,體重30-40g (雌雄不拘),购自斯莱克景达公司,在本校标准化实验动物中心常规饲养。

主要试剂:DMEM/F12(Biological Industries公司)、H-DMEM培养基及L-DMEM 培养基(Sangon Biotech公司)、胎牛血清(FBS)(Sigma公司)、胰酶(GENVIEW公司)。

1.2 细胞分离方式

小鼠脱颈处死,置于75%无水乙醇的烧杯中浸泡5min,在无菌条件下取后腿股骨,清除表面肌肉组织。刺穿股骨,分别用DMEM/F12、H-DMEM或L-DMDM培养液(含10% FBS)冲洗骨髓,200目筛网过滤后,用1ml注射器注入细胞培养瓶,37℃,CO2培养。常规培养3~4天后用PBS冲洗两遍,全量换液去除非贴壁细胞。当细胞生长至约80%融合时,用0.25%胰酶和0.01%EDTA消化,计数,传代。

1.3 细胞培养体系比较

(1)不同血清含量的比较:分离后的单个核细胞以1×106接种至6孔板中,用DMEM/F12培养液含5%,10%,20%FBS进行培养,比较细胞生长情况。

(2)不同类型培基比较:分离后的单个核细胞以1×106接种至6孔板中,用10%胎牛血清DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM分别培养,比较细胞贴壁与生长情况。

2 结果

2.1 细胞分离方式

使用筛网细胞残留少,培养时细胞密度过低,难以存活,BMSCs数量少(图1);不使用筛网,可获取更多细胞,能使BMSCs贴壁与伸展,存活率明显高些(图2)。

2.2 细胞培养情况

2.2.1 不同血清浓度

用DMEM/F12培养液含5%,10%,20%FBS进行培养时,最佳的血清浓度是10%,细胞增殖旺盛,形态均一,易于传代。过高的血清浓度>15%时,会导致细胞出现分化的现象,传代较难。过低的血清会<10%时,导致细胞的增殖速度下降,未能增值传代。

2.2.2 不同类型培基

10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养按照1:1比例混合效果最佳,营养成分丰富,呈长棱形成纤维细胞样的细胞。(图3)10%胎牛血清的H-DMEM细胞培养,可见数个成纤维细胞样,细胞轮廓增强,细胞折光性变弱,细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质。(图4)。含10%胎牛血清的L-DMEM培养,仅见个别成纤维细胞样,细胞形态出现多样性,贴壁细胞浮起。(图5)

3 讨论

间充质干细胞来源于中胚层,具有很强的自我复制能力和多向分化潜能,它分布于全身各结缔组织,尤以骨髓中含量最多,但即使是在骨髓中,BMSCs的丰度也不高,每105-106个单核细胞中大约含一个BMSCs,并且随着年龄的增长,BMSCs含量逐渐减少[1]。BMSCs具有支持造血,促进造血干细胞移植后造血功能恢复、预防和减轻移植后的移植物抗宿主病的潜能[2,4]。因此,建立一个体外适宜BMSCs生长培养体系是显得至关重要。

MSCs的分离技术和方法主要有4种:贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。应用流式细胞仪分离法或免疫磁珠法,虽可以得到纯度较高的细胞,但成本昂贵,在分离过程对细胞的活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性。使用percol1分离液梯度离心的方法,能有效地将红细胞、白细胞,和间充质干细胞分离开来,同时操作简单,快速,对细胞的活性影响较小,但要是血管中细胞量少,分离得到的单个核细胞数量更少,不利于细胞的生长。贴壁法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法,至今仍是一种得到广泛应用的经典途径[3,5]。本实验采用贴壁培养法,并经过体外贴壁培养一段时间,通过换液去除悬浮生长的造血细胞,从而获得BMSCs。

在原代分离时,细胞分离方式中是否使用筛网对BMSCs的生长有一定影响,使用筛网细胞的密度过低,存活率难,BMSCs数量少;而无使用筛网细胞,能使BMSCs贴壁与伸展,存活率高,可获取更多细胞。最佳的血清浓度是10%,生长最为旺盛:血清浓度<10%,不利于细胞生长;血清浓度>15%时,易引起细胞分化而影响增值。应用L-DMEM培基未能获得可增殖传代的间充质干细胞,H-DMEM培基获得少量可增值传代细胞,而DMEM/F12和得到了均一的、可传代的间充质干细胞。

本实验对其分离、培养条件进行优化,结果显示不使用筛网细胞,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12M培养基培养,能够提高培养效率。

参考文献

[1]张怡,赵连三,唐红,等.小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养[J].生物医学工程学杂志,2004,21(5):746-748,765.

[2]宋一雪,王军,陈虎.间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用[J].现代生物医学进展,2009,9(5):986-1000.

[3]裴瑛波.骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(14):2775-2778.

[4]金建刚,冯凯,石炳毅,等.MSCs诱导移植物免疫耐受的研究进展[J].临床血液学杂志,2009,22:58-60.

[5]宫晓洁,孙莉,黎靖宇.小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及形态学观察[J].解剖学研究,2008,30(1):54-56.endprint

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