铜离子代谢结构域包含体1对胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用与机制研究

阮东+郭丽蕊+王芳+袁凡恩+陈谦学+刘宝辉

[摘要] 目的 探討铜离子代谢结构域包含体1（COMMD1）在胶质瘤细胞U87中的作用及机制。 方法 使用siRNA敲低U87细胞内COMMD1的表达量，使用CCK8检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，免疫印迹技术检测p65、cleaveage-caspase3及BAD蛋白表达量。 结果 CCK-8结果显示，0、1、2、3 d时siNC组U87细胞活力为（0.401±0.001）、（0.452±0.002）、（0.621±0.002）、（0.823±0.003），siCOMMD1组为（0.402±0.000）、（0.510±0.001）、（1.021±0.002）、（1.612±0.002），两组相比，在2、3 d时细胞活力差异有统计学意义（P < 0.05）。流式细胞术结果显示，两组细胞凋亡率为（7.121±0.520）%和（2.214±0.325）%，siNC组高于siCOMMD1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。Western blot结果显示，下调COMMD1后，p65蛋白表达增加40.132%，BAD表达量增加90.157%，cleaveage-caspase3表达减少56.169%。 结论 COMMD1可以调节胶质瘤细胞U87的凋亡与增殖。

[关键词] 铜离子代谢结构域包含体1；增殖；凋亡

[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（b）-0004-04

The effect of copper metabolism domain containing 1 in U87 cells proliferation and apoptosis and mechanism study

RUAN Dong1 GUO Lirui2 WANG Fang2 YUAN Fan′en2 CHEN Qianxue2▲ LIU Baohui2▲

1.Department of Neurological Surgery， the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science and Technology Xianning Central Hospital， Hubei Province， Xianning 437100， China； 2.Department of Neurological Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To study the biological function of copper metabolism domain containing 1（COMMD1） in glioma cells U87 and its mechanism. Methods siRNA transfection was applied to knock down COMMD1 expression in U87 cells. CCK-8 and flow cytometry analysis were employed to examine glioma cells proliferation and apoptosis after COMMD1 was knocked down. Western blot was used to detect the expression of p65， cleaveage-caspase3 and BAD levels. Results Data showed that when COMMD1 was knocked down by siCOMMD1， the CCK8 results of siCOMMD1 were （0.402±0.000）， （0.510±0.001）， （1.021±0.002）， （1.612±0.002）， while the CCK8 results of siNC were （0.401±0.001）， （0.452±0.002）， （0.621±0.002）， （0.823±0.003） at 0， 1， 2， 3 d； there were significantly differences in cell viabilities between the two group at 2 d and 3 d （P < 0.05）. Flow cytometry analysis results showed that the apoptosis rate of cells in siCOMMD1 group and siNC group was （2.214±0.325）% and （7.121±0.520）%， there was significantly difference between the two group （P < 0.05）. Western blot results showed that the expression of p65 and BAD increased 40.132% and 90.157%， cleaveage-caspase3 decreased 56.169% when COMMD1 was knocked down. Conclusion COMMD1 can regulate U87 cells apoptosis and proliferation.

[Key words] Copper metabolism domain containing 1； Proliferation； Apoptosisendprint

胶质瘤是成人中枢神经系统最常见最致命的原发性恶性肿瘤，具有高发病率、高死亡率和预后差的特点[1- 2]，尤其是胶质母细胞瘤，其中位生存时间不足1年，主要是因为胶质瘤具有异常增殖、侵袭和抗凋亡的特点[3-5]，而机制尚不清楚。目前认为，胶质瘤治疗效果的提高依赖于对其分子机制的进一步研究[6-7]。本研究通过siRNA转染人脑胶质瘤细胞U87来敲低COMMD1的表达，研究胶质瘤异常增殖与凋亡的机制，对于探讨胶质瘤发生机制，进而提高胶质瘤治疗效果有重要意义。

1 资料与方法

1.1 细胞培养及siRNA转染

人胶质母细胞瘤细胞系U87购自中国科学院上海细胞库。本实验所使用的靶向COMMD1 siRNA及对照（si Negative control，siNC）均购自上海吉玛基因。详细细胞培养及转染方法参考文献[8-9]。

1.2 荧光定量PCR及免疫印迹实验

anti-COMMD1、anti-p65、anti-cleaveage-caspase3、anti-BAD及anti-GAPDH均购自Santa Cruze。具体实验方法参考文献[10]。荧光定量PCR结果使用公式2-ΔΔCt进行计算。

1.3 Cell Counting Kit-8（CCK8）及流式细胞术

具体实验方法参考文献[11]。CCK8结果计算方法为测试组CCK8值-空白组CCK8值，空白组为无肿瘤细胞，只加入培养基。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染siCOMMD1对U87细胞COMMD1 mRNA表达量的影响

荧光定量PCR结果显示，siNC组与siCOMMD1组U87细胞COMMD1 mRNA相对表达量分别为1、0.271±0.022，两组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 下调COMMD1对胶质瘤细胞U87增殖的影响

CCK-8结果显示，在0、1、2、3 d时siNC组的U87细胞活力为（0.401±0.001）、（0.452±0.002）、（0.621±0.002）、（0.823±0.003）；siCOMMD1组的U87细胞活力为（0.402±0.000）、（0.510±0.001）、（1.021±0.002）、（1.612±0.002），两组相比，在2、3 d时细胞活力差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 下调COMMD1对胶质瘤细胞U87凋亡的影响

流式细胞术结果显示，siNC组的U87细胞凋亡率为（7.121±0.520）%，siCOMMD1组细胞凋亡率为（2.214±0.325）%，两组相比差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 下调COMMD1对凋亡相关蛋白及p65表达量的影响

免疫印迹结果显示，下调COMMD1后，siCOMMD1组p65蛋白表达增加40.132%，BAD表达量增加 90.157%，cleaveage-caspase3表达减少56.169%。见图4。

3 讨论

COMMD家族蛋白作为体内许多生理功能的调控因子，对于维持细胞稳态有着重要的作用，其与人体的生物学特性有着密切联系[12-14]。COMMD1是COMMD家族的一个重要成员，可以通过参与泛素-蛋白酶体通路调节铜代谢、NF-κb通路活性、细胞周期等，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[15]。有研究表明，上调核内COMMD1表达可以增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性[7]，但其在胶质瘤中的作用尚不清楚。本研究结果显示，U87细胞中敲低COMMD1，细胞增殖能力在2、3 d时明显增强，两组差异有统计学意义（P < 0.05），提示敲低COMMD1可以提高细胞增殖能力。而流式细胞术结果显示，敲低COMMD1后，细胞凋亡率明显降低，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05），提示在胶质瘤中COMMD1可能为抑癌基因，表达降低可以促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡。虽然目前尚无COMMD1在胶质瘤中是抑癌基因的报道，但已经有文献报道，在B淋巴细胞中，COMMD1低表达是预后差的重要原因[16]。在肝癌中，COMMD1与肿瘤分化程度及发展有关，可为判断病理分级及临床分期提供参考[17]。在成神经细胞瘤，COMMD1可以抑制细胞的生长[18]，卵巢癌中可以提高对顺铂的敏感性[19]。虽然不能从COMMD1在肝癌、成神经细胞瘤及卵巢癌中是抑癌基因推断出其在胶质瘤中也是抑癌基因，但以上结果，至少从侧面支持本研究观点。

COMMD1在胶质瘤中调节细胞增殖和凋亡的机制尚未见相关报道，但已有文献报道COMMD1可以通过泛素化途径调节p65的表达，进而调节NF-κB信号通路[15]。在成神经细胞瘤中，其可以通过促进NF-κB信号通路的p65降解，从而抑制NF-κB信号通路[18]。本研究结果显示：在胶质瘤细胞U87中，敲低COMMD1，NF-κB信号通路的重要蛋白p65表达量明显升高，提示COMMD1可以激活NF-κB信号通路。而NF-κB信号通路在胶质瘤中发挥重要作用，抑制NF-κB信号通路活性可以促进胶质瘤细胞的凋亡，抑制胶质瘤细胞的增殖[20-22]。据此推测，COMMD1可能是通过抑制NF-κB信号通路抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的。

总之，本研究发现，敲低COMMD1，胶质瘤细胞U87的增殖能力增強，凋亡能力降低，其在胶质瘤中可能为抑癌基因，机制可能是通过调节NF-κB信号通路实现的。

[参考文献]endprint

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（收稿日期：2017-07-03 本文编辑：程 铭）endprint