散结通络方对缺血性肾病晚期大鼠MMP—2、TIMP—2表达的影响

王蕊+陈桂梅+李伟+刘兰英++李娇艳++李根茂+葛东宇++王耀献

[摘要] 目的 探討散结通络方对缺血性肾病晚期大鼠肾组织基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP-2）表达的影响。 方法 将SD雄性大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组（均给予生理盐水3 mL/d）、药物组[散结通络方10.85 g/（kg·d）]，采用单侧肾动脉不全结扎术建立模型。于实验第28天检测大鼠24 h尿蛋白定量及血肌酐。处死大鼠，取肾组织做光镜检查，观察各组大鼠肾脏形态学改变；免疫组化法检测肾组织MMP-2、TIMP-2表达。 结果 光镜下模型组和药物组大鼠的肾小球及肾小管间质均有损伤。与假手术组比较，模型组和药物组肾小球硬化指数评分及肾小管间质损伤评分均明显升高（P < 0.01），而药物组较模型组降低（P < 0.01）。与模型组比较，药物组MMP-2表达升高（P < 0.01），24 h尿蛋白定量、血肌酐及TIMP-2表达降低（P < 0.01），且两组均高于假手术组（P < 0.01）。 结论 散结通络方可能通过上调MMP-2、下调TIMP-2在肾组织中的表达对缺血性肾病晚期病变起防治作用。

[关键词] 散结通络方；缺血性肾病；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶组织抑制因子2；大鼠

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（b）-0024-04

Effects of Sanjie Tongluo Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2， tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in rats with ischemic nephropathy of advanced stage

WANG Rui1 CHEN Guimei1 LI Wei1 LIU Lanying1▲ LI Jiaoyan1 LI Genmao2 GE Dongyu2 WANG Yaoxian3

1.Department of Nephrology， the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2.Basic Research Center， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3.Department of Nephrology， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Sanjie Tongluo Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2 （MMP-2）， tssue inhibitor of metalloproteinase-2 （TIMP-2） of nephridial tissue in rats with ischemic nephropathy of advanced stage. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group （both groups were given normal saline 3 mL/d）， drug group [Sanjie Tongluo Decoction 10.85 g/（kg·d）] by random number table method. The unilateral renal artery insufficiency ligation was used to establish animal model. In the 28th day of experiment， the levels of 24 hours urinary protein and creatinine of rats were detected. The rats were put to death and nephridial tissue was collected to take light microscope examination， the changes of renal morphology in all groups were observed. Immunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-2 and TIMP-2 of nephridial tissue. Results Under the light microscope， the glomerulus and tubulointerstitium in the model group and drug group had damage. Compared with sham operation group， the scores of glomerulosclerotic index and tubulointerstitial lesion in the model group and drug group were all increased （P < 0.01）， which of drug group were lower than those of model group （P < 0.01）. Compared with model group， the expression of MMP-2 in drug group was increased （P < 0.01）， 24 hours urinary protein， creatinine and the expression of TIMP-2 were decreased （P < 0.01）， which of both groups were higher than those of sham operation group （P < 0.01）. Conclusion Sanjie Tongluo Decoction can prevent the lesions of ischemic nephropathy of advanced stage by up-regulating the expression of MMP2 and down-regulating the expression of TIMP-2.endprint

[Key words] Sanjie Tongluo Decoction； Ischemic nephropathy； Matrix metalloproteinase 2； Tissue inhibitor of metalloproteinase 2； Rats

缺血性肾病是指肾动脉狭窄或阻塞，超过管腔60%，造成肾脏血流动力学改变，肾脏严重缺血而导致慢性肾脏病[1]。本课题组在临床应用散结通络方治疗缺血性肾病晚期患者有显效的基础上[2]，通过对缺血性肾病晚期大鼠肾组织病理变化及应用免疫组化法测定基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP-2）在肾组织中表达的变化，探讨散结通络方干预缺血性肾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠30只，2～3月龄，体重190～220 g，北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2012-0001。经北京中医药大学伦理委员会批准。饲养于北京中医药大学实验动物房，每笼10只，温度（23±2）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环，自由饮水，普食。

1.2 主要试剂

MMP2抗体（BA0569）、TIMP2抗体（BA0576）（武汉博士德生物工程有限公司）；血肌酐测试盒（D130916）（南京建成生物工程有限公司）；尿微量白蛋白检测试剂盒（Axis-Shield PoC AS）。

1.3 药物

散结通络方（北京康仁堂药业有限公司配方颗粒剂），具体组成如下：生黄芪10 g、当归10 g、党参10 g、熟大黄5 g、川芎10 g、地龙10 g、海藻10 g、牡蛎30 g、莪术10 g、夏枯草30 g。

1.4 方法

1.4.1 分组 将36只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组（12只）、模型组（12只）、药物组（12只）。

1.4.2 建模 大鼠适应性生长1周后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（0.4 mL/kg）腹腔麻醉后剪开腹腔，药物组和模型组剥离出左侧肾动脉，将0.25 mm×40 mm的针灸针与肾动脉长轴平行放置，用1号手术缝合线将肾动脉和针灸针扎在一起，抽出针灸针，关闭腹腔（动脉结扎为同一人操作）。假手术组只打开腹腔后缝合。术后次日自由进食水。药物组2只死于麻醉意外，模型组2只建模次日死亡，假手術组无死亡，为数据一致，假手术组随机取10只大鼠。

据缺血性肾病文献[3]制订造模成功的标准，具体如下：①实验动物伤口愈合。②体重下降，饮食运动量减少，体毛无华。③尿蛋白及血肌酐升高。④手术侧肾脏体积缩小。镜检：肾小管损伤为主，肾小管结构明显破坏，小管上皮细胞脱落、凋亡及坏死变性，小管萎缩，肾间质炎症细胞弥漫性浸润，肾小球系膜细胞增生，皮髓质胶原纤维广泛沉积，肾间质纤维化伴肾小球硬化。

1.4.3 给药方法 各组大鼠均从术后次日开始灌胃。药物组：散结通络方10.85 g/（kg·d）（人临床用量的7倍），每日1次；模型组和假手术组：生理盐水3 mL，每日1次。连续用药28 d。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 生化指标 大鼠于代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液，测定24 h尿蛋白定量。于10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，腹主动脉取血3～5 mL，3000 r/min离心5 min，血清保存于-20℃冰箱，外送检测血肌酐。

1.5.2 肾组织染色评定肾小球硬化指数评分与肾小管间质损伤评分 取左侧肾脏，冲洗，去包膜，常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3 μm切片，行HE、Masson染色。光镜下各选20个视野行肾小球硬化指数评分与肾小管间质损伤评分[4]。肾小球硬化指数评分按正常、轻、中、重度分为0～3级。肾小球硬化指数评分=[（1×n1+2×n2+3×n3）/每片肾小球总数]×100%。n1～n3为1～3级肾小球个数。肾小管间质损伤评分分别按正常、轻、中、重度为0～3级，相应记为0～3分。

1.5.3 免疫组化法检测MMP-2、TIMP-2 切片烤片，脱蜡，水化；热修复后冷却；PBS冲洗；加3% H2O2去离子水，室温孵育20 min，PBS冲洗；滴加稀释一抗（抗MMP-2、抗TIMP-2），4℃过夜；室温20 min，PBS冲洗；滴加聚合物辅助剂，孵育20 min，PBS冲洗；滴加辣根酶标记抗山羊IgG聚合物，37℃孵育20 min，PBS冲洗；DAB显色，镜下观察细胞着色，常规脱水、透明、封片。采用Image-Pro P1us 6.0专业图像分析软件，比较各组平均光密度值。

1.6 统计学方法

运用SPSS 20.0软件，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜改变

2.1.1 HE染色 假手术组：肾组织结构清晰，肾小球和肾小管结构正常，肾间质无炎症细胞浸润。模型组：肾小管结构明显破坏，小管上皮细胞大量脱落、坏死，小管显著萎缩，肾间质大量炎症细胞弥漫性浸润，小球系膜细胞增生，肾小球硬化。药物组：肾组织病变较模型组减轻，小管基底膜相对完整，小管上皮细胞部分空泡变性，炎症细胞浸润减轻，肾小球轻度硬化。见图1（封三）。

2.1.2 Masson染色 假手术组：肾组织结构清晰，肾间质无纤维组织增生。模型组：皮髓质胶原纤维广泛沉积。药物组：胶原纤维增生较模型组减轻。见图2（封三）。

2.2 病理评分

模型组和药物组肾小球硬化指数及肾小管间质损伤评分均显著高于假手术组（P < 0.01），而药物组肾小球硬化指数及肾小管间质损伤评分低于模型组（P < 0.01）。见表1。endprint

注：与假手术组比较，*P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.01

2.3 血肌酐、24 h尿蛋白

与假手术组比较，模型组和药物组血肌酐、24 h尿蛋白升高（P < 0.01）；与模型组比较，药物组血肌酐、24 h尿蛋白降低（P < 0.01）。见表2。

2.4 MMP-2、TIMP-2的表达

MMP-2、TIMP-2阳性表达主要在肾间质细胞胞浆，肾小球少量表达。假手术组均呈弱阳性表达；模型组MMP-2呈阳性，TIMP-2呈强阳性；药物组MMP-2呈强阳性，TIMP-2呈阳性。见图3～4（封三）。

2.5 MMP-2、TIMP-2的光密度值

与假手术组比较，药物组与模型组MMP-2、TIMP-2表达均增高（P < 0.01）；与模型组比较，药物组MMP-2升高，TIMP-2降低（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

散结通络方是本课题组针对缺血性肾病晚期病变研制的复方，依据临床[2]及实验研究[5-6]，结合络病理论[7]，提出了缺血性肾病基本病机为肾络损伤，肾络绌急，进而肾络郁滞、瘀阻、瘀塞致肾络微型癥瘕。病初肾络郁滞，脉络郁滞致脉络瘀阻。肾络瘀塞为肾络绌急、瘀阻发展致肾络阻塞血流中断，形成肾络微型癥瘕。“不通”为贯穿始终的病理变化，故治疗以“通”为用，本研究针对病变晚期肾络瘀塞形成肾络微型癥瘕病机，治法以破瘀消癥、散结通络为主。方中黄芪、当归、党参为益气补血之佳品，改善肾络气血中断之不足。“血中气药”川芎营气助血，活血祛瘀，破除脉络瘀阻，改善气血壅滞。地龙搜风通络，更助气血运行。熟大黄泻火解毒力缓，不伤正气。海藻、牡蛎消癥散结，与莪术、夏枯草配伍共奏散结通络、清热排毒之效。

缺血性肾病晚期病变以肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）为主要病理表现[3]。本研究中，模型组术后28 d时肾组织病理改变与之符合，且血肌酐及24 h尿蛋白定量明显增高，以上病理改变及生化指标提示本研究造模成功。研究发现，RIF与细胞外基质（ECM）过度沉积和降解抑制密切相关[8]。正常情况下ECM处于一种合成与降解不断更新的动态平衡之中，病理情况下ECM异常合成或降解障碍将导致RIF。基质金属蛋白酶系统（MMPs/TIMPs）是调节ECM降解的关键系统，能降解除多糖以外的所有ECM成分。过量ECM沉积造成肾间质积聚、肾组织结构破坏及功能丧失，是慢性肾脏病终末期主要病理变化。MMPs/TIMPs在ECM的沉积与降解中发挥了重要作用。MMP-2可特异性降解Ⅰ、Ⅱ型胶原，分解多种ECM。TIMP-2能特异性抑制MMP-2，使ECM积聚。MMP-2/TIMP-2表达失衡与RIF关系密切。近年来诸多学者从动物实验及临床中西药等相关试验中均证实MMP/TIMP系统是调控RIF发生和发展的重要因素[9-20]。肾组织MMP/TIMP系统失衡，MMP表达降低，TIMP表达增加，可促进RIF，与本研究结果一致。本研究结果提示，与模型组比较，药物组MMP-2表达增高，TIMP-2表达减少，且与假手术组比较，两者均表达增加。由此推断MMPs/TIMPs系统在正常肾组织中少量表达，且呈动态平衡；而在病理情况下，MMPs/TIMPs系统被激活，两者均增高，RIF水平与MMP-2水平呈负相关，与TIMP-2呈正相关。

由此推断，散结通络方可能通过上调MMP-2、下调TIMP-2在肾组织中的表达来调控MMP/TIMP系统平衡，从而抑制肾间质纤维化程度，延缓缺血性肾病发展进程。

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（收稿日期：2017-07-02 本文编辑：张瑜杰）endprint