家族性肥厚型心肌病心脏型肌球蛋白结合蛋白C基因c.G772A突变研究

刘杰++刘福颂+王芳+邢晓博+樊光红++朱玉召++张克传++孙芳芳

[摘要] 目的 研究中國人家族性肥厚型心肌病（HCM）的致病基因，分析基因型与临床表型的关系。 方法 以2016年青岛市第三人民医院心内科1例住院患者为先证者的HCM家系，在此HCM家系中进行了包括心脏型肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC3）在内的30个HCM相关的致病基因的编码区及侧翼区进行了检测，利用靶向外显子捕获测序的方法对HCM先证者的30个与遗传性心肌病相关的基因进行全外显子扩增和高通量测序，进一步通过Sanger测序法在家系内及200名健康志愿者中进行验证。家系调查资料包括临床表现、体格检查、心电图及超声心动图。 结果 该家系共6人，有血缘关系的4例研究对象中，3例携带MYBPC3基因c.G772A杂合错义突变，该突变位点位于MYBPC3基因第6号外显子上，并使258位的谷氨酸（E）变为赖氨酸（K），该家系先证者携带MYBPC3突变，中年发病，临床表型温和，超声示室间隔明显增厚（厚度为18.3 mm）。 结论 MYBPC3基因c.G772A杂合错义突变可能是该HCM家系的致病突变，其携带者临床表型温和，有的无临床表现，提示其他因素如其他基因、年龄、环境等因素参与了HCM的发展过程。

[关键词] 肌球蛋白结合蛋白C；肥厚型心肌病；突变

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（b）-0065-04

Research on the mutation of cardiac myosin binding protein C gene c.G772A in familial hypertrophic cardiomyopathy

LIU Jie*▲ LIU Fusong*▲ WANG Fang XING Xiaobo FAN Guanghong ZHU Yuzhao ZHANG Kechuan SUN Fangfang

Department of Cardiology， the Third People′s Hospital of Qingdao， Shandong Province， Qingdao 266000， China

[Abstract] Objective To study the pathogenic gene of Chinese familial hypertrophic cardiomyopathy （HCM）， and to analyze the relationship between genotype and clinical phenotype. Methods One inpatient treated in Department of Cardiology， the Third People′s Hospital of Qingdao in 2016 was taken as the HCM family of proband， in which， the coding region and flanking region of 30 virulence gene related to HCM including cardiac myosin binding protein C （MYBPC3） were detected， and the 30 genes related to hereditary cardiomyopathy of HCM proband were identified by whole exons amplification and high-throughput sequencing through targeted exon trapping sequencing， and the identified mutation was further detected through bi-directional Sanger sequencing in the family members and 200 healthy volunteers. Pedigree analysis included clinical manifestation， physical examination， ECG and echocardiogram. Results Among 4 blood-related members in the six members of family， 3 members had MYBPC3 gene c.G772A hybrid missense mutation. The mutation was existed in the 6th exon of MYBPC3 gene， which made a 258-bit glutamic acid （E） into a lysine （K）. The proband of the family carried on MYBPC3 mutation， who was attacked in the middle-age， clinical phenotype was mild， and the ultrasound showed that the interventricular septum was significantly thickened （the thickness was 18.3 mm）. Conclusion MYBPC3 gene c.G772A hybrid missense mutation may be the pathogenic mutations of this HCM family. Some carriers have mild clinical phenotype， and some have no clinical manifestation， which suggests that other factors such as other genes， age， environment also participate in the development process of HCM.endprint

[Key words] Cardiac myosin binding protein-C； Hypertrophic cardiomyopathy； Mutation

肥厚型心肌病（HCM）是最常见的常染色体显性遗传的的心肌疾病，以劳力性呼吸困难、胸痛、晕厥、猝死、心力衰竭为临床症状，是导致青少年或运动员猝死的主要原因[1-2]，其发病率在普通人群中约为1/500[3]。其中50%具有明显的家族聚集性，称之为家族性HCM（FHCM）。肌球蛋白结合蛋白C（CMYBPC3）基因突变是导致HCM最常见的原因之一[4-5]。因HCM呈常染色体显性遗传，且杂合致病变异携带者其子女遗传该变异的可能性为50%，故对HCM患者及其家系成员的早期基因诊断和排查具有重要意义。本研究对一个汉族HCM家系进行了全面的致病基因检测，发现受检者携带MYBPC3基因p.E258K杂合错义突变，探讨其基因型与表型的关系，指导临床诊治。

1 对象与方法

1.1 对象

研究对象为一中国北方地区汉族HCM家系（图1），先证者为2016年青岛市第三人民医院（以下简称“我院”）心内科住院患者1例，共3代6人参与本研究。HCM诊断标准符合2011年美国心脏病学会基金会（ACCF）/美国心脏协会（AHA）HCM诊断和治疗指南的诊断标准，即临床上不能解释的、无心室腔扩张的左心室肥厚（超声心动图示左室厚度≥15 mm），且无其他导致心室肥厚的心脏疾病或系统性疾病[6]。同时满足2014年欧洲心脏病学会HCM诊断与治疗指南的诊断标准[7]。对照组200例健康志愿者。本研究经过我院医学伦理委员会批准，所有研究对象已签署知情同意书。

图1 携带MYBPC3 c.G772A（E258K）突变的家系图谱

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 临床资料包括体格检查、心电图、二维及多普勒超声心动图检查、冠脉CTA及冠状动脉造影。

1.2.2 基因组DNA提取 采集HCM患者及正常对照者外周静脉血5 mL，置于含有EDTA的抗凝管中备用，采用吸附法DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN公司，Hilden，Germany）提取血液样本中的DNA，经过琼脂糖电泳鉴定样本DNA质量合格后置于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 基因分析 用3.0 μg DNA作为起始，根据Agilent's SureSelect XT target enrichment system的实验流程来制备文库，再使用设计好的探针（诺心安panel Bestnovo公司，Beijing，China）对目标区域完成捕获，利用靶向外显子捕获测序技术对30个与遗传性心肌病相关的基因按照Illumina-SolexaHiSeq2000程序装置进行第2代测序（next generation sequencing，NGS），測序仪器为MiSeq System（Illumina公司，San Diego，California）。运用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq程序来分析测序结果，明确突变位点，进一步通过一代测序（Sanger测序法）在家系主要成员及200名健康志愿者中进行验证。

1.2.4 生物信息分析 突变通过检索千人基因组数据库、ESP6500数据库，均无人群频率报道。

2 结果

2.1 基因突变分析

本研究对HCM家系先证者进行了30个HCM相关基因的外显子编码区及侧翼区的筛查（图2）。在HGVS标准基础上与参考基因组NCBI Genome（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）比对，并综合考虑人群频率数据库Exome Aggregation Consortium（http：//exac.broadinstitute.org/）/1000 Genomes Project和致病性数据库ClinVar（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）/OMIM（http：//www.omim.org），由我们的遗传咨询团队评估得出。该HCM家系中3例患者携带心脏型肌球蛋白结合蛋白C基因（MYBPC3）c.G772A杂合突变，使258位的谷氨酸（E）变为赖氨酸（K）。该突变点为高度保守序列。MYBPC3基因6外显子的剪切位点突变E258K可能是该HCM家系的致病突变。在200名健康对照中未发现该突变位点。

图2 MBPC3基因的E258K突变测序结果

2.2 先证者临床表现

先证者（Ⅱ-1）为75岁女性，确诊为HCM，患者病史及辅助检查：“高血压”病史10余年，活动时胸闷、憋气、心悸10年，加重半年，心脏彩超报告显示室间隔基低段增厚，最厚处为16 mm，左室后壁9.6 mm，射血分数（EF）74%，左室流出道平均压差35 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），诊断为肥厚性梗阻型心肌病。冠状动脉CTA报告显示左右冠状动脉显影良好，冠状动脉起始处见点状钙化，但管腔未见明显狭窄。动态心电图示窦性心律，短阵室性心动过速、室性早搏、房性早搏。经给予美托洛尔、缬沙坦等药物，症状缓解。

2.3 家系临床资料分析

先证者有一儿一女，经检测均携带该致病基因。女儿50岁，为HCM患者，高血压4年，发作性心悸、胸痛7年，心脏超声见室间隔增厚，基地段增厚明显为18 mm，左室后壁8.9 mm，左室流出道平均压差7 mmHg，冠脉造影见回旋支散在斑块，远端闭塞，右冠未见明显狭窄。动态心电图示室性早搏、阵发性心房颤动。儿子为携带者，心脏超声检查未见明显异常，无胸闷、心悸、胸痛等临床症状。其外孙未携带该致病基因，先证者的丈夫已故。该HCM家系6人中2人被诊断HCM，1人为基因突变携带者。家系成员中突变携带者的临床资料见表1。endprint

3 讨论

HCM是一种由基因突变导致的家族遗传性疾病，带突变的mRNA和蛋白质表达在肥厚性心肌病患者的心肌中，表达出功能缺陷的蛋白质组装入肌小节被认为是HCM的主要发病机制。因为大多数起病缓慢，症状轻，往往表现为亚临床症状而难以被识别，心源性猝死可能为第一临床表现，突变的MBPC3基因是最常见的HCM原因之一，往往成年发病，而且有温和的表型[8]。被MYBPC3编码的蛋白由11个球状域、8个与IgI同源和3个纤维蛋白Ⅲ组成[9]，仅在心肌中表达，其磷酸化可调节心肌收缩。MYBPC是肌节蛋白的成分，既有结构作用，又有调节作用。通过结合肌球蛋白重链和肌细胞骨架蛋白，MYBPC3促成了肌节的结构完整性，也可以调节心肌对肾上腺激素的收缩反应[10-14]。MYBPC3 E258K基因突变导致HCM的可能机制：①降低了cMYBP-C的C1C2区域和肌球蛋白的S2区域之间的相互作用强度。②cMYBP-C的磷酸化状态及其消失，都通过相同的方式加速抽动的过程。③很有可能通过增强cMyBP-C和细肌丝之间的相互作用来降低抽动的强度[15]。

该家系HCM先证者携带的MYBPC3：p.E258K het变异，其在千人基因组数据库、ESP6500数据库均无人群频率报道，ExAC数据库的人群频率为0.000 039 03，为罕见变异。该变异曾被多个研究报道，被认为是HCM的致病变异[16-18]。研究发现，携带MYBPC3p.E258K het变异的患者其心肌组织中的肌球蛋白结合蛋白C含量下降了24%，由于单倍剂量不足而致病[19]。MYBPC3基因所致的HCM，其临床表型的出现具有年龄相关性，倾向于晚发型（>40岁），可呈不完全外显。该患者携带的MYBPC3：p.E258K het变异，从既往的家系研究来看，也表现为不完全外显，部分患者为家系筛查时发现存在心肌肥厚，有些携带者则并无明显心脏超声异常[16-17]。因此，在进行家系的临床筛查时，尤其是年轻携带者，建议制订长期随访计划。

家系中各成员病情进展程度不一致，心肌肥厚程度与临床症状基本与年龄成正相关，但先證者儿子为突变基因的携带者，尚未发病，提示HCM临床表型同时受致病基因和其他因素（如种族、生活方式、修饰基因的基因多态性等）的影响，反映该病的临床异质性。同时，经冠脉造影或CTA检查，该家系的2例HCM患者合并了冠脉病变：先证者为冠脉起始部的钙化，其女儿为冠脉的回旋支钙化并远端的闭塞。HCM同时合并冠心病使病情复杂，给诊断及治疗带来困扰。

HCM的临床表型是多变的，研究显示MYBPC3基因突变的HCM疾病发作常推迟到中年甚至老年，疾病的外显率也通常是随着年龄而增加的，而且有相对较为良性的预后[15]。但延迟的心脏改变和温和的临床进程可能会阻碍其遗传特性的识别，因此对家族其他成员的筛查能起到预警、早期识别作用，特别是对下一代测序更有助于破译肥厚性心肌病的遗传和表型的异质性，应给予基因检测，并进行长期的定时随访检查[20]。

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（收稿日期：2017-06-23 本文編辑：张瑜杰）endprint