视黄醇对大肠杆菌诱发的急性乳腺炎大鼠氧化应激的作用研究

2017-11-17 06:23顾蓓蓓卢劲晔
兽医导刊 2017年16期
关键词:视黄醇腺泡活性氧

顾蓓蓓 马 卉 卢 炜 刘 静 卢劲晔*

(1.泰州出入境检验检疫局,江苏泰州 225300;2.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300)

视黄醇对大肠杆菌诱发的急性乳腺炎大鼠氧化应激的作用研究

顾蓓蓓1马 卉1卢 炜2刘 静2卢劲晔2*

(1.泰州出入境检验检疫局,江苏泰州 225300;2.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300)

本文探讨视黄醇对大鼠大肠杆菌乳腺炎氧化应激的调节作用。选用72只清洁级SD大鼠,随机分成实验组和对照组(n=36)。怀孕后10d起,灌胃视黄醇(溶剂为大豆油)8000I.U/kg·d,连续灌注10d;对照组灌胃等体积的大豆油。产后72h,经乳头管灌注LPS 10μɡ/侧到第四对乳腺内。分别于灌注前(0h)及灌注后2、4、8、16和24h(n=6)颈静脉放血处死大鼠后采样。髓过氧化物酶活力检测结果与组织病理学观察显示,视黄醇降低了LPS诱发炎症过程中中性粒细胞在组织中的积聚与持续激活,有效控制了细胞损伤,并加快了组织修复;同时,视黄醇处理显著降低LPS灌注后IL-8及外周血PMN活性氧的释放。实验结果表明,灌胃视黄醇对LPS诱导的实验性乳腺炎大鼠PMN引起的氧化应激具有一定的保护作用。

视黄醇;中性粒细胞;活性氧;乳腺炎;大鼠

乳腺炎是导致奶牛业经济损失最严重的疾病之一。由于乳腺炎是由多种非特异病原微生物引起的,目前尚无有效的疫苗进行防治;抗生素和糖皮质激素虽然对乳腺炎有一定的治疗作用,但是乳汁中的药物残留会危害人的健康[1]。尽管乳腺组织中存在多种抗菌物质,如溶菌酶、乳铁蛋白等,嗜中性粒细胞(PMN)仍然是乳腺抵御外源病原微生物最主要的效应细胞[2]。

当乳腺遭受病原微生物或外源性致热源侵袭时,PMN首先被动员,从毛细血管经乳腺上皮细胞进入感染部位,识别和吞噬入侵病原。活化的PMN通过释放活性氧杀灭病原微生物,但PMN的持续过度激活,所产生氧化剂(次氯酸、酪氨酰基等)生成过量,超过局部抗氧化剂的防御反应时,能降解蛋白多糖,减少细胞外基质与乳腺上皮的粘附性,引起乳腺上皮细胞的死亡从而促进乳腺上皮的脱落和泌乳功能的损伤[3]。体外研究表明活化的PMN释放的活性氧自由基对培养的乳腺上皮细胞具有一定的细胞毒性作用[4]。

视黄醇是一类天然或人工合成的维生素A及其衍生物,能调节多种免疫细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞、PMN的功能)[5]。研究表明视黄醇通过提高机体的抗氧化水平,抑制机体超氧化物的产生保护乳腺组织[6]。本实验研究了灌喂一定剂量的视黄醇对LPS诱发乳腺炎症引起的中性粒细胞氧化应激的调节作用,深入阐明视黄醇对乳腺组织的保护机理。

1 材料与方法

108只清洁级健康SD大鼠,购自上海实验动物中心,其中雌鼠72只,体重260~300g,均未孕;雄鼠36只,体重350~400g。适应性饲养一周后,将雌鼠与雄鼠按2:1同笼饲养,使之交配受孕。大鼠自怀孕第10d起,灌喂8000I.U/kg·d视黄醇(溶解于大豆油),对照组大鼠灌喂等量的大豆油,连续灌喂10d。大鼠产后72h经乳头管注入内毒素10μg/侧到大鼠第四对乳腺(双侧)内,正常对照组注入等量灭菌的生理盐水。分别于灌注前(定义为0h)及灌注后2、4、8、16和24h(n=6)颈静脉放血处死动物,收集血清及肝素抗凝血500μL,采集乳腺组织,部分中性甲醛液固定,部分置于液氮后转存于-70℃中用于后续分析。

2 结果与分析

2.1 乳腺组织的病理组织学观察

图1 灌注大肠杆菌内毒素后乳腺组织PMN的动态变化(H.E.200×)C、T分别为对照组与实验组灌注LPS前0h,灌注后2、4、8、16、24h乳腺组织PMN的变化

组织病理学观察显示:LPS灌注前对照组和实验组腺泡结构均清晰可见,腺泡腔内乳汁充盈(腺泡内均匀分布的红色区域为着色乳汁);灌注LPS后,对照组第4h起腺泡中开始出现较多的PMN,同时,组织损伤开始出现,乳汁分泌量明显减少;组织病理变化第8h最为严重,此时腺泡腔内充满PMN,致使腺泡结构模糊难辨;第24h结果显示乳腺组织损伤有所修复。与对照组相比,视黄醇处理加快了PMN向腺泡内迁徙及炎症反应的进程,降低了组织损伤的程度;实验组病理变化最严重的时间点同样出现在LPS灌注后第8h,但病变程度要明显轻于对照组;实验组在第16 h腺泡内的PMN数量已经明显减少,乳腺的泌乳功能也有所恢复。

2.2 灌注LPS后乳腺组织与血清中MPO的活性变化

图2 灌注LPS后大鼠乳腺组织和血清中MPO活性的变化

乳腺组织中(图2 A)实验组和对照组MPO活性均先上升后下降。对照组灌注LPS后,MPO活性迅速上升,最高峰值出现在第8h(P<0.01),第16h该酶的活力仍显著高于0h(P <0.05);实验组在第8h达到峰值(P <0.05)后迅速下降,第16h已恢复至正常水平;血清中(图2B)的变化规律与组织中相反,MPO活性无论是实验组还是对照组同0h相比均先降后升,最低点同样出现在LPS灌注后的第8h,到24h有所恢复。

2.3 灌注LPS后乳腺组织与血清中IL-8的活性变化

图3 灌注LPS后大鼠乳腺组织和血清中IL-8的变化

如图3所示,与0h相比,LPS灌注后第8 h对照组乳腺组织中IL-8含量极显著升高8h乳腺组织中IL-8的活性(P <0.01),而实验组在各个时间点均无显著变化。与相应的0h相比,对照组第8h(P <0.01),实验组第4h(P <0.05)、8h(P <0.01)血清中IL-8含量显著升高;与对照组相比视黄醇处理的实验组显著下调第8hIL-8的含量(P <0.05)。

2.4 外周血中性粒细胞活性氧释放的动态变化

图4 LPS灌注后外周血中性粒细胞活性氧释放的动态变化

实验结果显示(图5),LPS灌注乳腺组织后,对照组和实验组各个时间点外周血PMN活性氧释放均显著升高;实验组与对照组相比,LPS灌注后第16h外周血PMN活性氧的释放极显著降低(P <0.01)。

3 讨论

乳腺炎包括乳腺感染、乳腺炎症、微循环和免疫障碍等的综合症,是制约奶牛业发展的主要疾病之一。大量循环血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺组织迁徙,是乳腺炎发生时的重要特征[7]。在本研究中,病理切片结果显示,实验组与对照组在灌注LPS前乳腺腺泡结构清晰,腺泡腔内乳汁充盈,灌注LPS后2h腺泡腔内开始出现PMN并在第8h达到浸润高峰,乳腺组织损伤严重,此后PMN浸润程度减轻,第24h基本恢复至正常水平。MPO是PMN的标志酶,组织中MPO活性的高低反映了PMN在组织中的潴留和活化程度[8],与病理切片结果一致,灌注LPS后,乳腺组织中MPO活性升高,同样在第8h达到峰值,血清中的变化趋势则与组织中相反,先降低而后升高,灌注后第8hMPO活性最低,动态反映了循环血液中PMN向乳腺组织迁徙的过程。

吞噬细胞,主要是嗜中性粒细胞是机体抵抗感染的主要非特异性防御细胞,任何PMN功能的障碍均会影响乳用家畜的生产性能[2]。PMN吞噬病原微生物主要是通过释放活性氧自由基(ROS)实现的,但是ROS的产生在杀灭病原微生物的同时,对宿主细胞和吞噬细胞本身也会造成损伤[3]。本研究中,LPS灌注后各个时间点,ROS释放均显著升高,视黄醇处理极显著的下调了LPS灌注后第16h ROS的释放。该结果与先前的报道(第一章)视黄醇能提高机体的抗氧化能力一致,这可能是视黄醇保护乳腺组织的重要机制之一。

LPS是重要的免疫细胞激活剂,通过激活NFκB/AP-1刺激单核、巨噬细胞产生多种细胞因子[9]。白细胞介素(IL)-8是炎症发生时一种重要的趋化因子,对PMN有激活作用,可以诱导其变形、趋化、脱颗粒、合成生物活性脂类、整合素上调以及呼吸爆发等。研究表明视黄醇可以抑制NFκB/AP-1活性从而下调相关炎症因子的基因表达。在本研究中,LPS灌注后对照组血清中IL-8显著升高并在第8 h达到峰值,视黄醇处理则显著降低了该时间点IL-8释放,表明视黄醇通过下调IL-8水平降低PMN活性氧的释放,从而保护乳腺组织。

4 小结

PMN是乳腺发生感染时的主要效应细胞,PMN通过释放大量高毒性的活性氧在消灭病原微生物的同时亦会引起乳腺组织的损伤。孕鼠灌胃视黄醇促进PMN迅速迁徙、粘附,发挥吞噬活性,同时视黄醇抑制PMN持续激活,降低活性氧的过度释放,减轻PMN对乳腺组织的损伤。

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江苏农牧科技职业学院科研课题(编号:NSF201609);江苏省现代畜牧与新兽药工程技术中心开放课题(编号:TGC2XKF1402);江苏高校品牌专业建设工程项目(PPZY2015C230)。

顾蓓蓓(1983—),江苏兴化人,博士,研究方向:乳腺炎的营养免疫调节机制研究。

卢劲晔(1983—),江苏邗江人,博士。

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