基于分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定蔬菜中多种除草剂残留的方法

平华，李杨，李冰茹，何昭颖，刘继培，马智宏



基于分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定蔬菜中多种除草剂残留的方法

平华1,2，李杨1，李冰茹1，何昭颖1，刘继培3，马智宏1

（1北京市农林科学院北京农业质量标准与检测技术研究中心，北京100097；2沈阳农业大学信息与电气工程学院，沈阳110866；3北京市大兴区土肥工作站，北京102600）

研究吸附填料不同添加量对除草剂回收率的影响，以建立蔬菜中24种除草剂残留的分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。蔬菜样品加入乙腈振荡提取，将净化填料N-丙基乙二胺（PSA）（不同添加量0.05 g、0.10 g、0.20 g）加入提取液中净化。采用UPLC-MS/MS测定，对液相色谱柱、流动相条件和质谱条件（锥孔电压、碰撞能量）进行优化，电喷雾电离，多反应监测模式检测。以0.1%的甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，各化合物峰形尖锐，灵敏度高，UPLC-MS/MS上机10 min内完成了24种除草剂的检测。添加0.10 g和0.20 g PSA时，三氟羧草醚、2,4-滴、唑嘧磺草胺、噻吩磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆6种除草剂回收率明显降低；其余除草剂随着PSA添加量的增加回收率没有明显的变化，在75.5%—114.7%之间；吸附填料PSA添加量为0.05 g时，24种除草剂回收率为65.6%—114.7%。24种除草剂在1.0—250 µg·L-1质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9946—0.9998。蔬菜中24种除草剂的方法检出限在1.2—160.8 µg·kg-1，定量限在4.0—536.0 µg·kg-1，可以满足定量分析的要求。在空白蔬菜样品中添加50、100、200 µg·kg-13个质量分数的24种除草剂的混合标准溶液，24种除草剂的回收率在66.5%—116%，相对标准偏差在2.3%—9.7%。采用建立的测定方法，对38份蔬菜样本进行检测发现，所有蔬菜样品中仅检出阿特拉津残留，检出率为57.9%，检出范围为未检出—0.84 µg·kg-1，其余23种除草剂均未检出。该方法简便、快速、节省溶剂、灵敏度高，可用于大批量蔬菜中除草剂残留快速检测。

超高效液相色谱串联质谱法；蔬菜；除草剂；分散固相萃取

0 引言

【研究意义】目前世界上除草剂品种超过300个，每年有效成分总产量70×104—80×104t，占化学农药总产量的40%—50%[1]。随着中国农业栽培耕作方式趋向于规模化和集约化发展，除草剂的使用量日渐增大，其销售总额已超过杀虫剂和杀菌剂，成为第一大类农药[2]。除草剂在使用后，大部分被吸附在土壤中，除了被杂草吸收外，还会被种植的农作物吸收，一旦进入食物链，会对人类健康造成危害。许多国家都开始制定除草剂残留限量，美国环保署规定大多数产品中三嗪类除草剂的最大残留限量为0.25 mg·kg-1，欧盟规定特丁津在蔬菜中最大残留限量为0.05 mg·kg-1[3]。中国食品中农药残留限量标准GB 2763—2016《食品中农药最大残留限量》中有关除草剂在蔬菜中的最低残留限量为 0.05 mg·kg-1。因此，需要建立蔬菜中除草剂快速提取、分离及测定方法。【前人研究进展】目前蔬菜中除草剂常用的净化方法有固相萃取、固相微萃取、凝胶渗透色谱和分散固相萃取法[4-8]等，其中分散固相萃取法快速、操作简便，是目前广泛使用的前处理方法[9]。常用的检测方法有气相色谱法[10]、高效液相色谱法[11-12]、气相色谱-质谱联用法[13]和液相色谱-质谱联用法[14-15]、酶联免疫法[16]等。近年来发展起来的超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）具有比传统方法快5—10倍的优势，可以根据待测物的性质选择不同的离子化模式，检测不同化学性质的除草剂，有广阔的应用前景[17-20]。【本研究切入点】目前检测方法多为针对三嗪类、磺酰脲类、苯脲类等某一种类型的除草剂，考虑到不同类型除草剂之间的联合毒性效应，本研究拟对目前使用量较大的三嗪类、酰胺类、磺酰脲类、二苯醚类等7种不同类型的24种除草剂进行同时测定。【拟解决的关键问题】研究不同净化填料及不同添加量对蔬菜提取液净化效果，以简化样品前处理过程；研究不同类型色谱柱、不同流动相、不同质谱条件对24种除草剂分离效果及灵敏度的影响，以提高定量的准确性。将分散固相萃取法与UPLC-MS/MS技术相结合，以提高检测效率，实现节省溶剂，保护检测人员健康和环境的目的，为大批量样品的检测提供简便、快速、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Xevo TQ三重四极杆质谱仪，配有ESI电离源（Waters公司）；3K30高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；纯水机（美国Pall公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；空气浴振荡器（哈尔滨市东明医疗仪器厂）；0.2 μm微孔过滤膜（美国Gelman Laboratory公司）；乙腈（HPLC级，美国Fisher公司）；36%盐酸（优级纯，北京化工厂）；无水硫酸镁（分析纯，北京化工厂），使用前马弗炉500℃加热5 h，冷却后放入干燥器备用；键合硅固相萃取吸附剂C18填料（日本YMC公司）；N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂填料（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

阿特拉津、西玛津、草净津、密草通、敌草净、另丁津、西草净、扑草净、扑灭通、扑灭津、莠灭净、特丁津、特丁净、异丙甲草胺、乙草胺、噻吩磺隆、三氟羧草醚、烯草酮、苯磺隆、唑嘧磺草胺、异噁草松、氯嘧磺隆、2,4-滴和氟磺胺草醚24种除草剂标准品（纯度均大于98%，农业部环境保护科研监测所）。将24种除草剂标准品配成混合标准储备液，实验时用初始流动相配成不同质量浓度的标准工作液。

1.2 前处理方法

蔬菜样品匀浆，精确称取5.0 g样品，加入乙腈溶液10.0 mL，振荡30 min，再加入4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，剧烈振荡1 min，4℃离心3 min（5 000 r/min）。精确吸取1.0 mL上清液至离心管中，加入0.05 g PSA粉末，振荡1 min，4℃离心3 min（5 000 r/min），取0.5 mL上清液，加入乙腈﹕水（1﹕1）0.5 mL，混匀后过0.2 μm滤膜，UPLC-MS/MS测定。

实验中对PSA、C18两种不同的净化方法分别进行了优化，在上清液中分别加入0.05 g PSA和0.05 g C18比较其净化效果，选出合适的净化填料；然后分别在上清液中添加0.05 g、0.10 g和0.20 g PSA，比较PSA不同添加量的净化效果，最终采用上述优化后的方法。

1.3 分析条件

1.3.1 超高效液相色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；色谱柱温：40℃；样品室温度：10℃；进样体积：5 µL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水，流速为0.3 mL·min-1；梯度洗脱条件：0—0.25 min，10%—30% A；0.25—7.0 min，30%—70% A；7.0—8.0 min，70%—95% A；8.0—10.0 min，10% A。

采用HSS T3 C18、BEH C18两种不同的色谱柱分别进行实验，比较24种除草剂在色谱柱上的峰形、分离效果及响应值，以选择一个适宜的色谱柱。对流动相条件进行优化，在流动相B（水相）中分别添加0.05%、0.1%、0.2% 3种不同比例甲酸时，对比24种除草剂的峰形、分离度和灵敏度，选择一个合适的甲酸添加比例，最终采用上述优化后的条件。

1.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子和负离子模式；监测模式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压：1.0 kV（正离子模式，ESI+）；1.0 kV（负离子模式，ESI-）；雾化气温度：400℃；去溶剂气流量：800 L·h-1；碰撞气流量：0.15 mL·min-1；离子源温度：150℃。

采用24种除草剂的混合标准溶液优化质谱条件。根据化合物的性质，采用ESI+或ESI-扫描模式进行一级质谱分析，分别选择准分子离子[M+H]+或[M-H]-为母离子，优化了24种除草剂的锥孔电压（2—80 V），选择每个化合物母离子响应值最高时的电压为最佳锥孔电压；然后优化了24种除草剂二级质谱的碰撞电压（2—80 eV），选择每个化合物的两个碎片离子响应值最高时的电压为最佳碰撞电压，两个碎片离子响应值最大的为定量离子，反之为定性离子。

1.4 实际蔬菜样品的测定

为了验证该方法的适用性，在北京昌平区、顺义区蔬菜大棚分别采集了黄瓜、小白菜、蒿子杆、尖椒、西红柿、茄子、豆角、韭菜、洋葱等38份蔬菜样本，采用上述优化好的方法对蔬菜中24种除草剂的残留情况进行了测定。叶菜类：小白菜、蒿子杆、韭菜、大白菜、芥菜、生菜、油菜、圆白菜；茄果类：茄子、辣椒、西红柿、圣女果；瓜类：黄瓜、苦瓜；豆类：豆角、豇豆；鳞茎类：葱头。计算不同类型蔬菜中除草剂检出率，分析比较了不同类型蔬菜中除草剂残留量大小。

2 结果

2.1 净化方法的选择

C18、PSA为分散固相萃取中常用的净化填料，具有简便、快速、净化效率高等特点[21]。试验对比了0.05 gPSA和0.05 g C18净化效果，发现提取液用PSA净化后回收率平均值为94.6%，C18净化后回收率平均值为76.6%，PSA净化效果优于C18，因此选择PSA为净化填料。随后比较了PSA不同添加量的净化效果，添加0.05 g、0.10 g和0.20 g PSA时，三氟羧草醚、2,4-滴、唑嘧磺草胺、噻吩磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆6种除草剂的回收率分别在65.6%—100.8%、43.7%—79.7%和24.3%—61.6%；其余18除草剂随着PSA添加量的增加回收率没有明显的变化，均在75.5%—114.7%。PSA添加量为0.05 g时24种除草剂回收率在65.6%—114.7%。因此，最终选择上清液中加入0.05 g PSA进行净化，实现去除杂质的同时对目标化合物不造成影响（图1）。

2.2 色谱条件的选择

由于24种除草剂性质各不相同，分属于7种不同类型，为获得好的峰形和分离效果需要对色谱条件进行优化。对比了24种除草剂在HSS T3 C18、BEH C18色谱柱上的峰形和分离效果，发现莠灭净、特丁净、乙草胺在BEH C18色谱柱上峰形较差，拖尾严重，而24种除草剂在HSS T3 C18色谱柱上峰形、分离度及响应值均优于BEH C18色谱柱，与文献相符[22]。同时考查了水相中添加不同比例甲酸（0.05%、0.1%、0.2%）对各化合物分离度和灵敏度的影响。结果表明，甲酸的加入有利于目标化合物离子化，提高灵敏度。其中加入0.1%甲酸时，各个化合物峰形好，响应值相对较高。因此最终选择HSS T3 C18色谱柱、0.1%的甲酸水-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，10 min内完成了24种除草剂的检测，分离度良好，峰形尖锐，灵敏度高。各个化合物总离子流见图2。

1.西玛津, 2.西草净, 3.敌草净, 4.阿特拉津, 5.密草通, 6.扑灭通, 7.莠灭净, 8.另丁津, 9.特丁津, 10.扑灭津, 11.异噁草松, 12.草净津, 13.特丁净, 14.扑草净 15.乙草胺,16.异丙甲草胺, 17.烯草酮, 18.氟磺胺草醚, 19.唑嘧磺草胺, 20.噻吩磺隆, 21.苯磺隆, 22.氯嘧磺隆, 23. 2,4-滴, 24.三氟羧草醚

2.3 质谱方法的选择

由于24种除草剂化学结构不同，电离方式也不同，分别选用正离子和负离子模式扫描。分别优化了锥孔电压和碰撞能量，使每种除草剂的母离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大，将响应值最大的碎片离子设定为定量离子，次级响应离子为定性离子。24种除草剂的质谱参数见表1。

2.4 方法的线性范围与检出限

用初始流动相配制1.0—250 µg·L-1系列质量浓度混合标准溶液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，24种除草剂在1.0—250 µg·L-1质量浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.9946—0.9998，可以满足定量分析的要求。以3倍信噪比计算，蔬菜中24种除草剂的方法检出限（LOD）在1.2—160.8 µg·kg-1；以10倍信噪比计算，蔬菜中24种除草剂的定量限（LOQ）在4.0—536.0 µg·kg-1（表2）。

2.5 加标回收试验

在空白蔬菜样品中添加50、100、200 µg·kg-13个质量分数的24种除草剂的混合标准溶液，按照上述优化的实验方法进行加标回收率实验，每个添加水平重复测定3次。结果表明，24种除草剂的回收率在66.5%—116%（表3）。

2.6 实际蔬菜样品的测定

按照优化的方法，对采集的38份蔬菜样本，包括黄瓜、小白菜、蒿子杆、尖椒、西红柿、茄子、豆角、韭菜、洋葱等蔬菜中24种除草剂的残留情况进行了测定。所有蔬菜样品中仅检出阿特拉津残留，检出22次，检出率57.9%，检出范围为未检出—0.84 µg·kg-1（表4），其余23种除草剂均未检出。阿特拉津平均残留量：叶菜类＞瓜类＞豆类＞茄果类＞鳞茎类。检出量相对较高的蔬菜品种为蒿子杆、韭菜、小白菜，均为叶菜类蔬菜（图3）。

图2 24种除草剂总离子流色谱图

1.小白菜, 2.蒿子杆, 3.韭菜, 4.韭菜, 5.韭菜, 6.黄瓜, 7.辣椒, 8.黄瓜, 9.水果黄瓜, 10.豇豆, 11.辣椒, 12.辣椒, 13.黄瓜, 14.苦瓜, 15.豆角, 16.大白菜, 17.辣椒, 18.辣椒, 19.茄子, 20.西红柿, 21.圆白菜, 22.茄子, 23.大白菜, 24.圆白菜, 25.生菜, 26.生菜, 27.芥菜, 28.油菜, 29.茄子, 30.茄子, 31.茄子, 32.圣女果, 33.西红柿, 34.黄瓜, 35.豇豆, 36.豆角, 37.葱头, 38.葱头

表1 24种除草剂的质谱分析参数

*代表定量离子* Represents quantitative ions in the table

3 讨论

分散固相萃取法是美国农业部于2003年提出使用的一种样品前处理技术，该技术的核心在于将固相萃取吸附剂分散到样品萃取液中吸附干扰物，保留目标化合物，避免了传统固相萃取法提取液因淋洗、洗脱、浓缩等引起的目标化合物的损失，净化液可以直接进行色谱分析[23-24]。该方法适用范围广，分析物包括高极性、非极性、高酸性和碱性等化合物，还具有溶剂使用量小、污染少、不使用含氯化物溶剂、样品处理量大的优点[25]。常用的吸附填料有PSA、C18、GCB（石墨化炭黑）等，用于除去基质中的色素、脂肪酸、甾醇类、糖类等杂质，吸附剂种类和用量可以根据目标化合物的性质和基质干扰程度进行优化。其中，PSA为一种弱阴离子交换剂，同时含有伯胺和仲胺基团，能有效地去除中提取液中的色素、脂肪酸、糖类和其他有机酸等杂质，还可通过氢键作用结合一些共提物。周瑶敏等[26]采用PSA作为吸附剂对大米提取液进行净化，测定了大米中的6种酰胺类除草剂。邱世婷等[27]对比了PSA、C18和GCB对大豆提取液的净化效果发现，PSA对杂质的净化能力远远优于C18和GCB，基质效应明显较少。本实验中对比了PSA、C18的净化效果，也同样发现PSA比C18净化效果好。

表2 24种除草剂的线性方程、相关系数、方法检出限与定量限

因此，本实验选取PSA作为吸附剂。实验中发现当PSA添加量增加时，对目标化合物三氟羧草醚、2,4-滴、唑嘧磺草胺、噻吩磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆6种除草剂吸附能力也随之增加，6种除草剂的回收率随着PSA添加量的增加而降低。如添加量为0.1 g、0.2 g净化提取液时，2,4-滴的回收率分别为43.7%、24.3%，随着PSA添加量的增加回收率明显降低，与文献报道的结果相符[22, 28]。Ji等[29]分别对比了PSA不同添加量对三嗪类除草剂回收率的影响，结果发现PSA加入量为0.05 mg 时，三嗪类除草剂回收率较高，本研究结果与前人研究结果一致。王玉健等[30]采用加入0.05 g PSA净化提取液，高效液相色谱串联质谱法测定了果蔬中的阿特拉津、扑草净、西玛津、莠灭净、朴灭津、西草净6种三嗪类除草剂，检出限为5.0 µg·kg-1，本试验中这6种除草剂的检出限在1.6—3.2 µg·kg-1，低于文献方法。

表3 加标回收试验结果

表4 蔬菜样品中除草剂检出情况

ND: Not detected

目前除草剂的色谱检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱质谱法、高效液相色谱串联质谱法等。其中，气相色谱和液相色谱法仅以保留时间定性，化学性质相近的除草剂无法分开，影响定性定量，且容易出现假阳性结果。气相色谱质谱和液相色谱串联质谱法由于检出限低、灵敏度高、定性定量相对更加准确，在痕量样品的分析中得到了广泛应用[31]。近年来随着超高效液相色谱串联质谱仪的应用，使得分析速度大大提高，节省了有机溶剂的使用，与气相色谱质谱法相比，节省了4倍以上的分析时间，提高了检测效率。因此在本实验中选用了超高效液相色谱串联质谱法同时测定24种除草剂，10 min即可以完成蔬菜中痕量除草剂的分析，具有快速、灵敏度高、定性定量准确的优势。

4 结论

建立了超高效液相色谱串联质谱法测定蔬菜中24种除草剂残留量的方法。采用分散固相萃取法净化蔬菜提取液，并考察了不同吸附剂的净化效果，简化了操作步骤，净化效果好且回收率符合要求。采用优化的超高效液相色谱质谱条件，10 min内即可完成24种除草剂的同时测定。建立的检测方法具有简单、快速、节省溶剂、准确、灵敏度高的特点，适用于大批量蔬菜样品中除草剂多残留的检测，为实际样品的检测提供检测依据。

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（责任编辑 李云霞）

SimultaneousDetermination of Multi Herbicides Residues in Vegetables by Dispersive Solid Phase Extraction and Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

PING Hua1,2, LI Yang1, LI BingRu1, HE ZhaoYing1, LIU JiPei3, MA ZhiHong1

(1Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097;2College of Information and Electrical Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866;3Soil and Fertilizer Workstation of Daxing Beijing, Beijing 102600)

To study the purification efficiency of different amount of absorption on the recovery of the herbicides, the ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) with dispersive solid phase extraction method was developed for the determination of 24 herbicides in vegetables．The vegetable samples were extracted with acetonitrile and purified by primary-secondary amine (PSA) with different dosage of 0.05 g, 0.10 g and 0.20 g. UPLC-MS/MS method was performed with electrospray ionization (ESI) source under the multiple reaction monitoring (MRM) mode．0.1% formic acid water-acetonitrile was chosen as mobile phase in gradient elution, and the peaks of all the compounds were sharp with high sensitivity under this conditions. 24 kinds of herbicides were detected by UPLC-MS/MS within 10 min. Adding 0.10 g and 0.20 g PSA, the recovery rate of acifluorfen, 2,4-Dicholrophenoxyacetic acid, flumetsulam, thifensulfuron methyl, tribenuron methyl, and chlorimuron ethyl was decreased significantly, and the rest of the herbicides recovery did not change significantly, ranging from 75.5% to 114.7%. When adding 0.05 g PSA, 24 herbicides recovery rate was 65.6%-114.7%. Standards concentration ranged from 1.0 µg·L-1to 250 µg·L-1had a good linear relationship, and the correlation coefficient was 0.9946-0.9998. Limits of detection of 24 herbicides in vegetables ranged from 1.2 to 160.8 µg·kg-1, and limit of quantitative between 4.0 and 536.0 µg·kg-1, which can satisfy the requirement of quantitative analysis. The mixed standard solution of 24 herbicides were spiked in the blank vegetable samples at three levels 50, 100, 200 µg·kg-1, and the recovery of 24 kinds of herbicides at the rate of 66.5%-116%, the relative standard deviation between 2.3%-9.7%, which can meet the requirements. Using the established determination method, 38 vegetable samples were detected, and only atrazine was detected in all vegetable samples with the detection rate of 57.9% and the detection range from not detected to 0.84 µg·kg-1. The other remaining 23 kinds of herbicides were not detected.The UPLC-MS/MS method is simple, rapid, solvent saving and sensitive, which is suitable for the determination of herbicides in a large number of vegetable samples.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; vegetables; herbicides; dispersive solid phase extraction

2017-06-03；接受日期：2017-07-27

北京市优秀人才项目（2015000020060G131）、北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20150301）、北京市农林科学院青年科研基金（QNJJ201521）

平华，E-mail：pingh@brcast.org.cn。通信作者马智宏，Tel：010-51503405；E-mail：mazh@brcast.org.cn