核酸适配体比色法检测恩诺沙星

赵银丽 王金荣 苏兰利

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

核酸适配体比色法检测恩诺沙星

赵银丽 王金荣 苏兰利

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

（目的）研究检测恩诺沙星的胶体金核酸适配体比色法，（方法）将恩诺沙星核酸适配体与胶体金结合后形成胶体金适配体复合物，然后加入恩诺沙星靶标分子，由于核酸适配体与靶标的高效特异性结合，核酸适配体与胶体金解离。最后加入NaCl后，胶体金由红变兰。（结果）胶体金比色检测体系中，NaCl的最佳浓度为1M，核酸适配体的最佳浓度为2μM。对恩诺沙星的比色检测限为 15ng/mL。（结论）基于胶体金和核酸适配体的比色法可用于恩诺沙星的快速筛选。

恩诺沙星；胶体金；核酸适配体；检测

恩诺沙星是动物专用的氟喹诺酮类药物，主要用于治疗畜禽细菌性疾病和支原体感染。但恩诺沙星的广泛应用造成了药物在动物体内的残留，如果人类长期食用含低残留的恩诺沙星食品，会对人类健康造成一定的危害。因此，通过有效的技术手段对动物组织中有关药物残留量进行检测是非常必要的。本研究利用恩诺沙星的核酸适配体，建立了基于胶体金和核酸适配体的检测恩诺沙星的比色法。

1 材料和方法

1.1 材料

恩诺沙星，环丙沙星，诺氟沙星，由中国兽医药品监察所提供；氯金酸（HAuCl4），柠檬酸三钠，氯化钠，由中国医药上海化学试剂公司提供。恩诺沙星的核酸适配体序列5’- CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA -3由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 柠檬酸钠还原法制备胶体金

将氯金酸配制成1%的母液，低温避光保存备用。用1%的氯金酸母液配制100ml 0.01%的氯金酸水溶液，用电炉加热至沸腾状态时，搅拌下均匀加入2.5 ml 1%的柠檬酸三钠，继续煮沸15min，然后室温冷却，得胶体金。

1.2.2 NaCL工作浓度的选择

向100μl胶体金溶液中加入20μl不同浓度的NaCl溶液（0 M、0.5M、1M、2M），然后加入100μl双蒸水，使体系总体积为220μl。观察胶体金颜色的变化，以凝聚胶体金变兰的浓度作为工作盐浓度。

1.2.3 核酸适配体ssDNA工作浓度的选择

向对照管中加入100μl胶体金和50μl灭菌双蒸水；向实验管中加入 100μl胶体金和50μl 不同浓度的ssDNA（0、1、2、4μM）。室温下孵育10min，然后各加入20μl NaCl（1M），观察胶体金溶液的颜色变化，根据其对胶体金的保护效果确定ssDNA的工作浓度。

1.2.4 核酸适配体比色法检测恩诺沙星

首先向每个反应管中加入100μl 胶体金和 50μl ssDNA，室温孵育10min，然后向对照管中加入50μl 灭菌的双蒸水，向实验管中加入不同浓度的恩诺沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室温下继续孵育10min，然后向所有管中各加入20μl NaCl（1M），观察胶体金溶液的颜色变化。

1.2.5 核酸适配体比色法对恩诺沙星检测的特异性

首先向每个反应管中加入100μl 胶体金和 50μl ssDNA，室温孵育10min，然后向对照管中加入50μl 灭菌的双蒸水，向实验管中加入不同浓度的恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室温下继续孵育10min，然后向所有管中各加入20μl NaCl（1M），观察胶体金溶液的颜色变化，确定其检测的特异性。

2 结果

2.1 NaCl工作浓度的选择

向胶体金中加入不同浓度的NaCl盐溶液（0 M、0.5M、1M、2M），观察胶体金颜色的变化。结果见图1.从结果来分析，胶体金溶液随着NaCl添加浓度的增加，呈现从红到紫、再到蓝色的变化。与对照管胶体金相比，0.5M 的NaCl溶液使胶体金变紫，1M的NaCl溶液使胶体金变兰。所以，1M 的NaCl溶液作为下一步实验的选择浓度。

图1 凝聚胶体金溶液变兰的盐工作浓度选择

2.2 核酸适配体ssDNA工作浓度的选择

向对照管中加入胶体金和灭菌水，向实验管中加入胶体金和不同浓度的ssDNA（0、1、2、4μM）。孵育后各加入NaCl（1M），观察胶体金溶液的颜色变化。从结果分析，添加2μM ssDNA实验管中的胶体金溶液颜色没有变兰，说明可以保护胶体金。所以确定2μM ssDNA 为工作浓度。结果见图2.

图2 核酸适配体ssDNA工作浓度的选择

2.3 胶体金核酸适配体比色法检测恩诺沙星的灵敏性

每个反应管中加入 胶体金和 ssDNA，室温孵育10min，然后向对照管中加入灭菌水，向实验管中加入不同浓度的恩诺沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室温下继续孵育10min，然后向所有管中各加入 NaCL（1M），观察胶体金溶液的颜色变化，结果见图3.同对照管相比，添加不同浓度的恩诺沙星的实验组，发生了颜色变化。并且随着浓度的增加颜色从红色向紫色、蓝色变化。通过肉眼观察，15ng/ml 实验管颜色明显变兰，可作为肉眼比色的检测限。

图3 胶体金核酸适配体比色法检测恩诺沙星的灵敏性

2.4 胶体金核酸适配体比色法检测恩诺沙星的特异性

每个反应管中加入 胶体金和 ssDNA，室温孵育10min，然后向对照管中加入灭菌水，向实验管中加入不同浓度的恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室温下继续孵育10min，然后向所有管中各加入 NaCL（1M），观察胶体金溶液的颜色变化，结果见图4。

同对照管相比，添加不同浓度的恩诺沙星的实验组，发生了颜色变化。并且随着浓度的增加颜色从红色向紫色、蓝色变化。通过肉眼观察，15ng/ml 实验管颜色明显变兰，可作为肉眼比色的检测限。而添加环丙沙星和诺氟沙星的实验组（0，1，5，10，15，30 ng/ml），没有发生颜色的变化。说明，在 1～30 ng/ml 浓度范围下，此检测方法只对恩诺沙星敏感。也说明了对恩诺沙星检测的特异性。

图4 胶体金核酸适配体比色法检测恩诺沙星的特异性

3 讨论

目前，对于恩诺沙星的检测主要有色谱法和免疫学方法。色谱法需要昂贵的仪器和专门的人员，样品前处理也较烦琐，在基层大规模筛选中应用受到一定的限制，常作为确证方法使用。而以抗体为核心试剂建立的免疫学方法，简便、快速，常作为筛选方法使用。适配体作为一种单链DNA 分子，可以吸附在纳米金表面，保护纳米金免于高盐引起的纳米金团聚。当加入对应的靶标时，适配体与靶标结合，从纳米金上解离，失去保护的纳米金在高盐浓度下发生团聚，溶液颜色由红变为紫色或蓝色，而且颜色的变化与加入靶标的浓度成正比，可用于很多种物质的检测。纳米金比色法具有结果肉眼可见、无需复杂仪器测量。纳米金比色法在毒素、四环素、磺胺药的检测中得到了应用。本研究中，基于胶体金和适配体的比色法可以实现对恩诺沙星的检测。

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河南省科技攻关项目（152102210263）

赵银丽（1973—），女，山东莘县人，副教授，博士，主要从事兽药残留检测研究。