基于新型介质阻挡放电离子源的药物快速检测方法研究

洪欢欢+赵鹏+宁录胜+闻路红+徐铁峰

摘 要 本研究将单电极放电技术的DBDI与质谱（MS）联用，快速检测了4种低极性的合成药物，结果表明， 4种合成药物主要生成[M+H]+分子离子。此外还利用DBDIMS對草乌、制草乌切片进行快速分析，在草乌中检测到乌头碱、中乌头碱、脱氧乌头碱的[M+H]+离子，以及[M+H-60]+碎片离子； 在制草乌中只检测到乌头碱、中乌头碱、脱氧乌头碱的[M+H-60]+碎片离子。所测草乌中的标志性药效成分主要为双酯类生物碱，制草乌中的标志性药效成分主要为单酯类生物碱。新型DBDI为药物研究提供了一种新的、快速检测方法，具有十分重要的理论和实际应用意义，在药物研究领域具有极大的应用潜力。

1 引 言

敞开式质谱离子源技术是一种新型的、敞开式的、直接对样品或样品表面进行分析的质谱分析技术，广泛应用于食品检测、爆炸物分析、中草药分析等多个领域[1～3]。经过多年的发展，常压敞开式离子化技术的种类已超过了40种，并建立了各具特色的质谱分析方法。

介质阻挡放电（Dielectric barrier discharge， DBD），又称无声放电，是一种新型敞开式离子化技术[4]。2007年，Na等[5，6]提出了基于介质阻挡放电的离子源（Dielectric barrier discharge ionization， DBDI）。2008年，Harper等[7]在DBDI的基础上，发展出低温等离子体离子化方法（Lowtemperature plasma， LTP）。 2016年， 宁波大学闻路红课题组提出一种稳定、高效的DBDI单电极放电技术，并基于该技术成功研制出新型介质阻挡放电离子源（DBDI）[8]，具有操作简单、快捷、无需复杂的样品前处理、可以与各种质谱仪器联用等优点，同时兼具传统质谱的高分析速度、高灵敏度等特点。

DBDI技术在食品安全[5]、爆炸物检测[6]、环境污染物监控[9，10]等诸多领域已展现出广泛的应用前景。DBDI可以离子化极性范围更大的化合物，对ESI难电离的物质具有较高的灵敏度[11]，可用于合成药物中极性范围较大的主要药效成分的检测。 Liu等[12]将低温等离子体（LTP）探针离子源和质谱联用，对激素，解热止痛剂，心血管等11种商业药物进行检测，实现药物快速和高通量筛选； Hiraoka等[13]提出一种基于快速热解析技术的DBDIMS方法，可有效实现氯雷他定、依替唑仑等多种难挥发和非挥发固态药品检测，检测限可达ng级别； Zhang等[14]将毛细管电泳（CE）、表面等离子体共振（SPR）与DBDIMS在线组合，对含盐溶液中的小分子药物（醋氨酚、奎宁等）进行分析，发现DBDI对不挥发盐表现出更高的耐受性，可应用于一些特殊条件下的研究。DBDI技术也适用于中草药研究，解决传统检测技术存在用样量大、样品制备耗时等缺陷。如Smoluch等[15]基于热辅助的DBDIMS分析技术对植物基质中8种合成大麻素进行分析，只需少量的样品（约数百微克）即可实现“特制药物”中大麻素类似物和衍生物的分析， 且无需样品前处理和溶剂萃取。文献[16，17]用LCMS方法检测草乌与炮制品的主要药效成分进行区分辨别，但检测方法需要耗时较长的萃取和样品制备过程。

本研究将基于单电极放电技术的新型DBDI与质谱（MS）联用，对4种低极性的合成药物和草乌、制草乌中标志性药效成分进行快速分析，进一步探索新型DBDI在药物研究领域中的应用价值。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

DBDI机箱、DBDI离子源（中国宁波华仪宁创智能科技有限公司）； 500质谱仪（美国Varian公司）； LTQ质谱仪（美国赛默飞公司）； 微电极玻璃毛细管（中国武汉微探科学仪器有限公司，Glass capillaries， B10024F，外径1 mm，内径0.59 mm，长度100 mm）。

甲醇（质谱级99.99%，上海安普实验科技股份有限公司）； 氦气（99.99%，宁波百方气体有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 样品制备 MCT3IM2、MCT2PBD、MCTIME、MCTIMA由北京某药厂合成，分别用甲醇溶解，配制成50 mg/L的标准溶液； 乌头碱（Aconitine， AC）、中乌头碱（Mesaconitine， MA）标准品（Sigma Aldrich公司）分别用甲醇溶解，配制成20 mg/L的标准溶液； 生草乌、制草乌购自宁波市中草药市场。

2.2.2 实验平台搭建

基于DBDIMS的液体样品实验平台搭建如图1所示，具体如下：毛细管虹吸方式进样，将DBDI水平放置向LTQ质谱喷射，毛细管样品端距LTQ质谱进样口0.5 cm，DBDI和MS进样口的距离为2.0 cm，等离子束对准LTQ质谱进样口中心偏下约2～3 mm处。氦气气瓶出气口处接减压阀，气瓶通过外径φ4气管与DBDI机箱进气口连接。DBDI单极放电工作的原理见文献[8]。

中草药实验平台搭建参照图1，具体如下： DBDI100 45°反射式进样，将生草乌、制草乌切片放于DBDI的辅助配件固体样品夹上，上表面紧贴500质谱进样口下方，DBDI距500 质谱仪进样口2.0 cm，氦气气瓶出气口处接减压阀，气瓶通过外径φ4气管与DBDI机箱进气口连接。

LTQ质谱条件设置：毛细管温度为275℃； 离子透镜补偿电压为35 V； 毛细管电压为7 V，LTQ质谱检测m/z 50～800。

2.2.3 合成药物检测 将浓度为50 mg/L的MCT3IM2、MCT2PBD、MCTIME、MCTIMA的甲醇溶液，通过毛细管虹吸进样，氦气流速为3.0 L/min，DBDI控制氦气温度分别为100℃、200℃和150℃，谱图采集时间为0.5 min。endprint

2.2.4 中草药检测 将浓度为20 mg/L的乌头碱、中乌头碱标准溶液，通过毛细管虹吸进样，氦气流速为4.0 L/min，DBDI的加热温度为200℃，谱图采集时间为0.5 min。

将生草乌、制草乌切片，用镊子夹住，放置在固体进样平台上，氦气流速为4.0 L/min，DBDI的加热温度为200℃，谱图采集时间为1 min。

3 结果与讨论

3.1 合成药物的DBDIMS研究

用DBDIMS对4种合成药物进行检测分析，在DBDI控温100℃时，MCT3IM2离子化结果主要生成[M+H]+（m/z 287）离子，其噪声较明显。在DBDI控温200 ℃时， MCT2PBD离子化结果主要生成[M+H]+（m/z 270）离子，其响应信号和信噪比的效果好； MCTIME主要生成[M+H]+（m/z 547）离子，在结构S氨基砜结构位置发生了断裂，生成[M+H-124]+（m/z 423）碎片离子。MCTIMA除生成[M+H]+（m/z 465）离子外，由于没有S氨基砜结构保护，不同位置的CO键在高能下容易发生断裂，出现了2种断裂形式（图2D），在1位点断裂生成特征碎片离子[M+H-173]+ （m/z 292），在2位点断裂生成特征碎片离子[M+H-264]+（m/z 201）。实验结果表明， DBDI对4种低极性合成药物具有较好的电离效果（见图2）。

3.2 草乌生物碱的DBDIMS研究

草乌的主要标志性有效成分为双酯类生物碱，包括乌头碱、中乌头碱与次乌头碱（Hypaconitine， HA）等。

乌头碱、中乌头碱、脱氧乌头碱标准品的质谱结果如图3所示。在正离子模式下检测到乌头碱标准品[M+H]+（m/z 646）离子，还检测到[M+H-60]+（m/z 586）碎片离子（图3A1）。随着离子化时间的延长， [M+H]+（m/z 646）离子的相对丰度逐渐降低，[M+H-60]+（m/z 586）碎片离子的相对丰度逐渐增加，最后只检测到[M+H-60]+（m/z 586）离子（图3A2）； 中乌头碱标准品主要生成[M+H]+（m/z 632）离子，同时还生成[M+H-60]+（m/z 572）碎片离子（图3B1）； [M+H]+（m/z 632）离子的相对丰度逐渐降低，[M+H-60]+（m/z 572）碎片离子的相对丰度逐渐增加，最后只检测到[M+H-60]+（m/z 572）離子（图3B2）； 脱氧乌头碱标准品除生成的[M+H]+（m/z 630）离子外，还生成[M+H-60]+（m/z 570）碎片离子（图3C1）； 与乌头碱、中乌头碱相似，脱氧乌头碱[M+H]+（m/z 630）离子的相对丰度逐渐降低，[M+H-60]+（m/z 570）的相对丰度逐渐升高，最后只检测到[M+H-60]+（m/z 570）碎片离子（图3C2）。

由实验结果可知，在DBDI离子化作用下，乌头碱、中乌头碱、脱氧乌头碱除生成[M+H]+离子外，都失去一分子的乙酸， 生成[M+H-60]+碎片离子，此结果也符合文献[18]对乌头类生物碱第一活性基团是C8位乙酰氧基的描述。随着离子化时间延长，[M+H]+离子的相对丰度逐渐降低，[M+H-60]+离子的相对丰度逐渐升高。在软电离条件下会发生特征断裂，生成单酯生物碱[M+H-60]+特征碎片[19，20]，与本研究结果一致。

3.3 草乌与制草乌的DBDIMS研究

草乌中含有双酯类和单酯类生物碱，而炮制过的乌头块根中含有单酯类生物碱[16，17]。 双酯类生物碱在炮制过程中会发生酯键水解反应，先失去骨架上的C8位乙酰基生成单酯类生物碱，再继续水解失去苯甲酰基生成乌头原碱[21]。本实验用DBDIMS方法比较草乌与制草乌中标志性乌头类生物碱的谱图差异（图4）。根据荷质比可分为m/z 500～600与m/z 610～650 两个区域，分别对应单酯类生物碱和双酯类生物碱。在草乌中检测到相对丰度较低的次乌头碱[M+H]+（m/z 616）离子、中乌头碱[M+H]+（m/z 632）离子与乌头碱[M+H]+（m/z 646）离子。还检测到乌头碱[M+H-60]+（m/z 586）碎片离子、中乌头碱[M+H-60]+（m/z 572）碎片离子、脱氧乌头碱[M+H-60]+（m/z 570）碎片离子以及次乌头碱[M+H-60]+（m/z 556）碎片离子，其中乌头碱[M+H-60]+碎片离子的相对丰度最高（图4A）。在制草乌中只检测到相对丰度较高的次乌头碱[M+H-60]+（m/z 556）碎片离子、中乌头碱[M+H-60]+（m/z 572）碎片离子、乌头碱[M+H-60]+（m/z 586）碎片离子，未检测到次乌头碱、中乌头碱和乌头碱的[M+H]+离子及脱氧乌头碱的[M+H-60]+碎片离子（图4B）。

本研究将DBDIMS联用，检测从当地中药市场购买的草乌、制草乌，实验结果表明， 草乌中的化学成分主要为双酯类生物碱和单酯类生物碱，制草乌中的化学成分主要为单酯类生物碱。依据文献[21]对草乌炮制程度的描述，表明本次检测中购买的制草乌炮制程度处于第一阶段。双酯类生物碱失去骨架上的C8位乙酰基生成单酯类生物碱。 本方法可以在无需样品前处理的条件下对草乌、制草乌的标志性化合物进行快速鉴定，能够快速、灵敏地区分其炮制程度的不同，对草乌、制草乌的品质鉴别及正确使用具有重要的意义。

4 结 论

本研究将新型DBDI与MS联用，对4种低极性的合成药物进行分析，实验结果表明， 4种合成药物主要生成[M+H]+分子离子峰，同时MCTIMA发生结构断裂，产生特有的碎片离子，有利于该物质的鉴定与结构分析，表明新型DBDI对4种药物具有较好的电离效果。同时， 对草乌、制草乌切片进行快速分析，实验结果表明， DBDIMS方法在无样品前处理的条件下成功检测到草乌、制草乌的乌头碱、次乌头碱、中乌头碱等标志性药效成分，其中草乌中含有双酯类和单酯类生物碱，制草乌中主要为单酯类生物碱，表明DBDIMS方法能够快速、灵敏地鉴定草乌和制草乌的真伪、质量和炮制程度。本研究结果表明， 新型DBDI技术为药物研究提供了一种新的、快速检测方法，具有十分重要的理论和实际应用意义，在药物研究领域具有极大的应用潜力。endprint