qPCR检测结核杆菌在肺和胸膜上皮样肉芽肿性疾病诊断中的意义

陈 昕，陈灵锋，黄 颖

qPCR检测结核杆菌在肺和胸膜上皮样肉芽肿性疾病诊断中的意义

陈 昕，陈灵锋，黄 颖

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction, qPCR)法在诊断及鉴别诊断肺和胸膜结核病和其他肉芽肿性疾病中的意义。方法收集经病理学检查发现上皮样肉芽肿性病变的肺和胸膜活检的石蜡包埋组织142例，应用qPCR法检测结核分枝杆菌DNA，同时行抗酸染色，并与临床资料对比进行回顾性分析。结果在142例肺胸膜活检标本中，60例临床诊断确诊为结核病。采用qPCR法检测结核分枝杆菌DNA阳性者58例，敏感性为96.67%，特异性为100%；抗酸染色阳性者17例，敏感性为28.33%，特异性为97.56%，差异有统计学意义(χ2=21.47，P<0.001)。结论结核分枝杆菌核酸检测有助于在石蜡包埋的肺和胸膜小活检组织中快速、准确的诊断结核病，可用于疑似结核的肉芽肿性病变的鉴别诊断。

结核；分枝杆菌；福尔马林固定石蜡包埋组织；荧光定量聚合酶链反应

结核是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，近年来发病率呈增高趋势。早期诊断并及时治疗是控制结核病疫情的关键，因此，准确、快捷、简便的检测方法具有十分重要的意义。常规病理确诊结核病，除了观察其特征性肉芽肿性病理改变，还需找到结核分枝杆菌。病理科常规开展齐-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法寻找病原菌，但抗酸染色普遍检出率低。近年来，荧光定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction, qPCR)法逐渐应用于临床检验，常用于痰液检测，也陆续见有报道用于病理石蜡包埋组织。本实验组在一组疑似结核的活检石蜡组织中同时采用qPCR法和抗酸染色进行检测，旨在评价两种方法在辅助病理确诊结核病中的价值与意义。

1 材料与方法

1.1一般资料选取福建省立医院2013年1月～2015年12月期间肺、纵隔活检组织经病理检查显示上皮样肉芽肿性病变、需排除结核病的石蜡包埋组织142例。其中肺、支气管活检组织99例，胸膜活检组织32例及纵隔活检组织11例(图1)。其中男性73例，女性69例，年龄14～77岁，平均年龄44岁。所有病例均同时采用qPCR法检测结核杆菌DNA，结合Ziehl-Neelsen抗酸染色检查辅助诊断。本组142例肺、胸膜及纵隔活检组织中，临床确诊为结核病60例，非结核病82例。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 QIACUBE全自动核酸纯化仪(Qiagen公司，德国)；Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪(Qiagen公司，德国)。

1.2.2试剂 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat.56404, Qiagen公司，德国)；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)[国食药监械(准)字2009第3400575号]。

1.3方法

1.3.1qPCR 每例活检石蜡组织10 μm厚切片8片，提取DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度和OD值(A260/A280比值在1.6～2.0间的为合格样本)。PCR扩增结核分枝杆菌特异插入片段IS6110。反应体系为40 μL(结核PCR反应液37.8 μL、Taq酶0.2 μL、UNG酶0.06 μL)；反应条件：37 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每批样本均设阳性对照、临界阳性对照及阴性对照，对照品均来源于试剂盒中的对照质粒DNA。结果判定：检测样本Ct值=40时，判为阴性；Ct值≤37.0时，判为阳性；Ct值介于37.0和40之间时，建议复检，复检结果Ct值<40者，判为阳性。

1.3.2抗酸染色 石蜡组织4 μm厚切片，常规二甲苯脱蜡至水；滴加苯酚碱性品红液37 ℃孵育15～30 min，水洗；滴加分化液分化数秒，充分水洗；滴加Mayer苏木精孵育30 s；流水冲洗10～15 min，干燥、透明、封固。结果判定：结核杆菌抗酸染色阳性，呈鲜红色；其他细菌及细胞呈蓝色。高倍镜下连续观察300个视野，未发现抗酸杆菌者，判为阴性；找到1～8条抗酸杆菌/300视野，判为可疑阳性(±)；找到>3条抗酸杆菌/100视野，判为阳性。

1.4统计学处理应用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，以临床诊断结果为金标准，分别计算灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值等。配对χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1抗酸染色法检测结核分枝杆菌19例抗酸染色结果为阳性，总体阳性率为13.38%(表1)；在60例临床确诊为结核病的活检组织中，17例抗酸染色阳性，敏感性为28.33%，特异性为97.56%，准确性为68.31%(图2)。

①A①B②A②B

图1肺和胸膜活检组织的上皮样肉芽肿性炎性病变：A.肺活检组织；B.胸膜活检组织，低倍镜下均呈慢性肉芽肿性炎性改变图2抗酸染色结果：A病例抗酸染色可见多量抗酸抗菌(蓝色箭头)；B病例抗酸染色为阴性

2.2qPCR法检测结核分枝杆菌142例疑似结核的肺、胸膜及纵隔活检组织标本中，58例结核杆菌核酸qPCR反应为阳性，总体阳性率为40.9%(图3)。在60例临床确诊为结核病的活检组织中，qPCR检测58例为阳性，2例为阴性，敏感性为96.67%，特异性为100%，准确性为98.59%(表1)。

本组142例肺、胸膜及纵隔活检组织标本中，17例qPCR和抗酸染色检测结核分枝杆菌均阳性，82例均阴性，符合率为69.72%(表2)。对两种方法进行Kappa检验，Kappa=0.301(P<0.001)，两者具有较好地吻合性。qPCR法敏感性高于抗酸染色法，差异有统计学意义(χ2=21.468，P<0.001，表1)。

表1 142例活检标本qPCR与抗酸染色检测结核分枝杆菌的结果

表2 抗酸染色与qPCR法检测结核分枝杆菌结果的一致性比较

图3 qPCR检测结果

A.图2A病例的qPCR检测结果示结核杆菌呈阳性；B.图2B病例的qPCR检测结果呈阴性

3 讨论

我国结核病防治形势很严峻，发病率高居全球第3位，而且耐多药结核病的疫情严重[1]。2007～2008年全国结核菌耐药性基线调查结果显示，我国肺结核患者中多药耐药率为8.32%，每年新发耐药的结核患者约为12万例，占全球每年新发病例总数的24%，位居全球的第2位[2]。2010年第五次全国结核病流行病学调查显示，一线抗结核药物耐药率为36.8%，二线抗结核药物耐药率为24.6%，总耐多药率为6.8%[1]。

结核病的特征性病理学改变是肉芽肿性病变伴有干酪样坏死。但结核的病理特征在HE染色中不具有特异性，很难与结节病及真菌感染等肉芽肿性疾病鉴别，一直以来病理科应用Ziehl-Neelsen抗酸染色寻找结核杆菌，与其他肉芽肿性疾病鉴别诊断，是病理学诊断结核病的一种首选的辅助手段。然而抗酸染色的特异性具有局限性，除了结核分枝杆菌外，其它一些引起人、畜共感染的杆菌，如牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及麻风杆菌等感染人体后均可呈肉芽肿性炎改变，或可伴干酪样坏死，并且抗酸染色均呈阳性[3]。因此，如果仅凭病理组织学形态和抗酸染色结果诊断，有可能将其他分枝杆菌感染误诊为结核。

qPCR技术是在传统PCR反应中引入荧光标记探针，操作步骤简单，又消除了非特异性扩增，从扩增到检测的全程 “闭管”操作，避免产物污染，大幅度降低了假阳性率。结核分枝杆菌3个序列常被选作目的扩增片段：16SrRNA、rpoB和IS6110，其中IS6110插入序列是结核分枝杆菌群特异序列[4-5]。本实验选用的试剂盒扩增结核分枝杆菌的特异序列IS6110。在本组病例中，qPCR法检测结核分枝杆菌显示出高度的敏感性及特异性，其敏感性远远高于抗酸染色法。

小活检组织病理诊断结核病更具挑战性，抗酸染色查找结核杆菌阳性率低，容易造成漏诊。迄今少有肺及胸膜活检组织中结核病诊断的大病例数报道。本组纳入142例疑似结核的肺、胸膜及纵隔活检组织，同时采用抗酸染色和qPCR法检测结核分枝杆菌进行辅助诊断。结合临床资料回顾性分析，临床确诊为结核病的60例中，qPCR检测阳性率为96.67%，抗酸染色阳性率为28.33%，qPCR法检测结核分枝杆菌敏感性明显高于抗酸染色法。抗酸染色及qPCR法检测核酸杆菌均具有很高的特异性，qPCR特异性为100%，抗酸染色特异性为97.56%。qPCR法检测核酸杆菌的阳性率高于以往54.6%[5]、64.6%[6]的报道。抗酸染色检测结核杆菌的阳性检出率普遍偏低，文献报道不一，本组病例抗酸染色阳性率为28.33%，低于既往51.3%[5]、39.8%[7]的报道，但接近于两组30.5%及32.5%的阳性率[6,8]。

分析本组病例抗酸染色阳性率偏低的可能原因：(1)可能由于本组病例为小活检组织，检出率受限于是否活检到包含结核杆菌的组织；但基于配对的qPCR反应显示很高的阳性率，提示本组病例的抗酸染色操作和评判可能存在不足。(2)活检组织仅含极少数的抗酸杆菌于镜下观察时被忽略。(3)认为抗酸染色的操作很可能是导致本组抗酸染色检出率低更为重要的原因。

抗酸染色的原理是加热条件下使分枝杆菌与石碳酸复红结合成复合物系盐酸乙醇处理不易脱色的牢固性结合，经碱性美兰复染后，分枝杆菌依然呈红色，突显于蓝色背景中。但在实际操作中由于各种原因，抗酸染色结果不太稳定，尤其在石蜡组织病理切片中的抗酸菌染上色后容易被盐酸乙醇脱色，导致假阴性，造成阳性率较低。孔洁等[9-10]对传统抗酸染色进行了改良，通过提高石蜡切片厚度；促染剂提高抗酸菌的被染色率；改良脱蜡液增加染色后抗酸菌的抗酸性，以及进一步优化背景染色，改良后的抗酸染色阳性率明显优于传统的抗酸染色法。

本组实验结果显示，在肺、胸膜活检组织中采用qPCR法检测结核分枝杆菌具有很高的敏感性及特异性，在辅助结核病的诊断中展示出良好的应用前景。

[1] 郑惠文, 赵雁林. 中国结核病耐药监测现状与监测体系建设[J]. 中国实用内科杂志, 2015,35(8):647-650.

[2] 廖 丽. 我国结核病流行现状及防治工作形势分析[J]. 中外医疗, 2014,3:129-130.

[3] 孙泉云, 王根龙, 陈 琦. 野生动物结核病研究进展[J]. 动物医学进展, 2010,31(8):93-97.

[4] Seagar A L, Neish B, Laurenson I F. Comparison of two in-house real-time PCR assays with MTB QPCR alert and genoType MTBDRplus for the rapid detection of mycobacteria in clinical specimens[J]. J Med Microbiol, 2012,61(10):1459-1464.

[5] 叶 丰, 陈 昱, 何 度, 等. 应用荧光定量聚合酶链反应对疑似结核组织的DNA分析[J]. 中华病理学杂志, 2013,42(8):534-537.

[6] 罗春英, 王建东, 王 璇, 等. 荧光定量聚合酶链反应检测石蜡包埋组织结核杆菌的应用价值[J]. 中华病理学杂志, 2012,41(8):562-563.

[7] 孙亚欣, 张志超, 董美玲, 等. 108例结核病变组织抗酸染色结果分析[J]. 中国实用诊断学, 2011,15(9):1586-1587.

[8] 曹燕珍, 胡佳捷, 王翠翠, 等. 实时荧光定量PCR在结核病中的诊断价值[J]. 医学理论与实践, 2015,28(23):16-17.

[9] 孔 洁, 谢惠康, 陈 岗. 一种在石蜡切片中应用的改良抗酸染色法的要点及解析[J]. 临床与实验病理学杂志, 2012,28(9):1062-1063.

[10] 王 弦, 吴 强. 石蜡组织切片抗酸染色方法的改良体会[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(10):1183-1184.

R 521； R 561

A

1001-7399(2017)10-1132-03

时间：2017-10-23 13:30 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.017.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.017

接受日期：2017-07-27

国家青年自然科学基金(81201794)、福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2015-ZQN-ZD-3)、福建省自然科学基金(2012J01117)、福建省医学创新课题(2012-CX-3)

福建省立医院病理科/福建省立临床医学院，福州 350001

陈 昕，女，技师。E-mail: 729039151@qq.com

黄 颖，女，博士，副主任医师，通讯作者。E-mail: huang_ying11@hotmail.com