正交设计优化硬叶兜兰SSR—PCR反应体系

郑之典　张罗霞　李宗艳

摘要：以构建珍稀物种硬叶兜兰SSR-PCR反应体系，采取正交设计试验对硬叶兜兰SSR体系组分中的Mg2+、基因组DNA、DNA Taq聚合酶、dNTPs、引物5个因素在4个不同程度上进行了组合试验，之后对反应体系中该引物的退火温度在梯度PCR仪上筛选，并进行了最优体系的验证。试验结果显示：体积为10μL的PCR管中最优组合为：模板 DNA 20 ng，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8 U，10 × buffer（ Mg2+Free） 1 μL，引物PR710的退火温度为59.6 ℃，说明该体系具有较好的实用性。

关键词：硬叶兜兰；正交设计；SSR

中图分类号：S682

文献标识码：A文章编号：16749944（2017）21009505

1引言

硬叶兜兰（Paphiopedilum micranthum）是兰科中珍稀物种，主要分布于我国西南部，其观花时间长，花色朴素淡雅，花型独特，具有非常高的观赏价值[1，2]，在多国举行的兰花展场上曾经获得总冠军。近年来人们对硬叶兜兰野生种过度的挖掘使得个体和居群数量快速下降，因此对其研究和保护迫在眉睫。

目前硬叶兜兰的研究主要是关于繁殖生物学和保护生物学。国内利用无菌播种研究方法说明硬叶兜兰萌发率在50%左右，由于兜兰属植物种子没有胚乳，在种子培养时，适量的有机添加剂对其的萌发能提供较大的帮助[3]；在对其菌根研究发现，不同硬叶兜兰内生真菌生长速率差别很大，利用单菌丝团分离法效果显著，能解决分离过程污染问题[4，5]。

在保护遗传学研究方面，一些学者对硬叶兜兰野生群体研究结果说明，不同居群有相当高的遗传差异，而且野生群内部存在一定的空间结构，所以要考虑不同群体的遗传状况才能计划硬叶兜兰的就地保护[6，7]；有研究通过两种分子标记ISSR和SRAP对野生居群研究显示，硬叶兜兰在物种水平上有较高的遗传分化[8]；在栽培引种领域，曾宋君等[9]通过对硬叶兜兰进行温室栽培，从西南等地引种100株，成活了85株，但是植株形体较差，嫩叶发育不良，在两年内仅仅6株在培养基质里开花；有学者从硬叶兜兰在南部地区应用前景分析表明，在该地区栽培时不能正常发育，而且开花率极低，再者其花朵开放时间短，说明在此地种植是不合适的，当地引种的植株生长状况也证实此问题[10]；就目前硬叶兜兰生境调查情况显示，它主要生长在石灰岩和灌木丛中，伴生物种丰富，呈聚集性分布[11～13]。

对野生硬叶兜兰居群进行保护需要对居群遗传多样性和亲缘关系进行分析。然而现代分子标记技术具有不受环境、生育阶段、不同组织等影响，和其他标记相比具有不可替代的作用[14]。SSR（simple sequence repeat）又名微卫星，在亲缘关系、遗传遗传变异等方面有广泛的应用[15～17]。它具有位点多、多态性丰富、共显性、种属特异性，且重复性和稳定性好等特点，被认为是目前研究遗传最好的标记之一[18，19]。但是在兜兰属应用中几乎没有，在进行SSR分子标记时，反应体系中各种因素的浓度大小对试验效果具有重要作用。所以，一个最佳效果PCR体系的建立对SSR扩增结果准确性和重复性非常重要[20]。

鉴于此，本研究已硬叶兜兰基因组DNA为模板，利用正交表L16（45）对组合中的5个成分（基因组DNA、Mg2+、DNA Taq聚合酶、dNTPs、引物）在4个程度上试验对照分析，并讨论每个因素浓度的变化对结果的影响，最终確定各个因素的浓度，并对选择出的体系进行验证。为硬叶兜兰在在分子领域的研究奠基一定的实验基础。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1实验材料

选用云南东南部区域7野生硬叶兜兰居群叶片为实验材料。

2.1.2设备和仪器

高速冷冻离心机（LCJ-64-01），PCR扩增仪（（美国 Bio-Rad 伯乐公司，Model：PTC—200）；电泳仪；凝胶自动成像系统（Kodark）；恒温水浴锅。

2.1.3试剂

所用引物来自近缘种同色兜兰（10对）和帝王兜兰（7对），经过首次的筛选，选择扩增出条带明亮的PR710引物（F：GGAGACACACACACACACACA，R：GGTCTTGGGACACACACACAC）应用于此次试验。Mg2+（20 mmol/L）、Taq聚合酶（2 U/μL）、dNTPs（2.5 mmol/L）、Marker（DL2000）、10×PCR Buffer 均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

2.2方法

2.2.1试验方法

采用修改优化过的的CTAB法[21]对硬叶兜兰叶片DNA进行提取，并凝胶在电泳仪上测试DNA提取的效果，在分子实验室里选择达标的样品进行实验，并将浓度稀释至 20 ng/μL。

2.2.2试验设计与分析

对SSR-PCR组合中的5个因素（基因组DNA、Mg2+、引物、dNTPs、DNATag聚合酶）在4个不同程度（表1）上变量处理，选用正交设计L16（45）正交表（表2），总共16个处理，每个处理设置3个重复，共48管，依照表中数据加入各个物质再进行扩增。总体系体积为10 μL，除了表中的5个因素，每管还有1 μL 10×PCR Buffer，最后加入 dd H2O 补齐到 10 μL。反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共38个循环，72 ℃延伸10 min，4℃保存。待时间结束，DNA片段用2.0%琼脂糖凝胶在6 V/cm电压下电泳约20 min，之后对实验结果拍照分析。endprint

2.2.3引物退火温度的选择

待16种体系处理完成检测后，选定最优的体系组合，调节引物退火温度为（59℃±5），在梯度PCR仪上依次生成12个不同温度，之后再将PCR产物进行电泳检测。

2.2.4最佳体系的验证

用最佳反应体系对硬叶兜兰7个野生居群DNA样本进行稳定性检验。

2.2.5数据分析

对16个体系的试验结果扩增出来的条带按照主带的明暗，杂带的数量等对每个结果打分，目的条带越明亮、清楚，杂带越少、得分越高，反之越低，最好可为16分，最差为1分（表3）。用SPSS19.0软件对3次评分结果做出数学统计分析。

3结果与分析

3.1不同处理打分和各个因素分析

3.1.1电泳结果评分

按表2对16个处理加样后，进行PCR扩增，将产物电泳并用进行拍照，如图1所示。参考何正文等[22]的试验分析理论，对PCR扩增出来的条带进行打分，如表3所示。

3.1.2各个组分对PCR结果影响的分析

用SPSS 19.0对表3数据进行数学方法处理，得到各个组分数据，从F值的大小可以看到引物浓度对PCR扩增影响相对最高，Mg2+的量对试验结果起到较小的作用，各个试验成分影响大小，由高到低排序：引物>基因组DNA>dNTPs>Taq聚合酶>Mg2+，由表中P值能得到5个PCR因素不同程度间比较的差异都超过了极显著刻度值，因此进一步对各因素进行因素内多重比较。

3.1.3因素内各水平对PCR结果的影响

（1）引物对SSR-PCR扩增的影响。由表4可知该物质含量对实验结果影响最大，引物的浓度能直接影响产物的生成，浓度过低，造成扩增的产物减少，过高能使引物与DNA模板之间碱基错配，生成不需要的二聚体[23]，由图2所示，浓度在0.8 μmol/L时所得评分结果最高，随着浓度的降低，评分越低。在对其不同程度进行因素内多重比较，发现其水平除了0.4 μmol/L和0.6 μmol/L两个梯度之间对试验效果影响不显著，其余各个水平差异都达到了显著水平，所以本实验显示引物水平取0.8 μmol/L浓度最合适。

（2）模板DNA对SSR-PCR的影响。除了引物，基因组DNA对试验结果的影响次之，SSR标记对模板DNA含量要求较低，含量过多不但引起材料的浪费，还增加非特异性产物，图3所示，水平在20 ng/μL评分结果最高，并随着浓度的增加，评分越来越低。在对模板在20 ng/μL和40 ng/μL之间差异不明显其余各个水平的差异都达到了极显著水平，本着节约试验材料原则所以DNA的含量选20 ng/μL。

（3）dNTPs对SSR-PCR的影响。dNTPs是碱基互补配对的4种脱氧核苷酸，也是PCR反应的原料，如果浓度过低造成片段数量的减少，图4表明浓度在0.3 mmol/L评分最高，少于或者多余此浓度评分都呈下降趋势。在对浓度进行因素内多重分析，发现第一个浓度与其余3个浓度存在差异显著，其余各个程度之间差异都不显著，比较而言，选择0.3 mmol/L作为dNTPs最佳浓度。

（4）Taq酶对SSR-PCR的影响。酶能提高扩增效率[24]，关系到PCR试验产物的多少，如图5所示，在本试验中0.8 U/μL评分结果最高，对 Taq酶的4 个浓度水平行进行因素内多重比较 ，结果显示，0.6 U/μL与0.7 U/μL两者结果差异不显著，其他水平之间都显著，因此选0.8 U/μL做为本试验Taq酶的浓度。

（5）Mg2+浓度对SSR-PCR的影响。本物质对试验结果影响最小，它与Taq酶结合[19]，影响产物合成的速率，过少造成产物的减少，过多引起非特异产物的生成，如图6所示，当水平在3 mmol/L试验打分结果最高，过高和过低打分都会下降，对 Mg2+浓度进行因素内多重比较，发现水平1与水平3和水平3与水平4之间试验差异达到极显著，其余水平之间不显著。综合比较选3 mmol/L为 Mg2+最佳浓度。

综上所述，本研究得到硬叶兜兰SSR-PCR最优体系为：10 μL 反应体系中，模板 DNA 20 ng，Mg2+ 3 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8 U/10μL，10×buffer（ Mg2+Free）1 μL。

3.2最佳退火温度的筛选

退火温度影响模板DNA与引物的结合，采用对引物推荐的退火温度59 ℃上下浮动5 ℃（59 ℃±5），在梯度PCR仪自动生成如图7所示梯度（退火溫度），试验结果用2%琼脂糖凝胶检验。如图7所示，温度过高和过低产物较少，电泳条带灰暗，因此选择最亮的条带（处理7）对应的温度59.6 ℃作为本引物的最佳退伙温度。

3.3PCR反应体系的验证

用优化好的体系模板 DNA 20 ng，Mg2+ 3mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8U/10 μL，10× buffer（ Mg2+Free） 1 μL，用双蒸水补齐至10 μL，对7个硬叶兜兰野生居群DNA样本进行检验，每个居群选取4个样本总共28个。如图8所示，每个样品都能扩增出明亮的条带，说明该体系比较稳定，可以为以后硬叶兜兰遗传多样性和亲缘关系相关的研究提供帮助。

4讨论与结论

PCP扩增反应中受许多因素和条件的限制[25～28]，研究的5个因素的含量的多少还有退火温度的的高低都对PCR扩增效率有重要的意义。设计正交试验对反应中的5个因素在4个程度上组合优化，使之能够利用有限的试验次数研究多个因素不同水平间的相互作用这比单因素试验更加可靠[25]。目前利用正交设计方法已经在许多物种SSR-PCR反应体系优化中得到应用[16，20]，但是在硬叶兜兰的研究方面，对体系的优化的报道较少。endprint

本研究中，引物浓度对试验结果影响最大，浓度过低会造成扩增反应无法启动，过高会造成不必要的引物二聚体的生成，但是在本试验中评分的结果根据引物浓度的变大而增加，在浓度达到0.8 μmol/L评分达到最大，在今后的研究中可以对引物浓度进行进一步的优化。许多研究表明，模板DNA的含量对试验结果的影响最大，这与本试验有些相似，DNA含量过多时会有较多的次生代谢产物，会对扩增反应起到抑制作用。其次四种核糖核苷酸对试验结果有着较大的影响，它是反应的基础，浓度太小会直接使产物量下降，过高会和Taq酶争抢Mg2+与之结合，造成Taq酶活性下降，从而影响产物的生成。Taq酶的浓度影响扩增的效率，但是浓度过高会引起错配的几率，过低造成产物的减少，本实验选择最高浓度的水平做为本研究体系中的最佳值，但是对Taq酶的浓度的选择可以在以后的研究可以继续优化。Mg2+ 浓度对试验结果的影响最小，这与许多学者研究相似，Mg2+可以催化Taq酶的聚合作用，含量的变化都会Taq酶的活性有着促进或者抑制的作用，在另一方面对试验存在着影响。

本试验研究优化硬叶兜兰基因组DNA SSR-PCR反应体系，在10 μL的体积中，模板DNA 20 ng，Mg2+3 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8 U/10 μL，10 × buffer（ Mg2+Free） 1 μL，不足用双蒸水补齐。在对退火温度的优化上，选择条带明亮对应的温度59.6 ℃做为引物PR710的最佳退火温度，并对反应体系进行的检测，结果表明该体系能够在不同的硬叶兜兰居群中应用，并且体系稳定，重复性好，为以后利用SSR标记硬叶兜兰在遗传变异和亲缘关系等方面打下良好的基础。

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Abstract：To construct the SSR-PCR reaction system of the rare species P.micranthum，the five factors （Mg2+，template DNA，polymerase，dNTPs and primers）in four levelswere optimized by using the orthogonal design method in P.micranthum SSR reaction system.The annealing temperature of the primer in the reaction system was then screened on a gradient PCR apparatus and the optimal system was verified.The results showed the optimal combination of the PCR reaction system with a total volume of 10μl，20 ngtemplate DNA ，3.0 mmol/LMg2+，0.3 mmol/LdNTPs，0.8 μmol/Lprimer，0.8UTaq DNA polymerase and1μL10 × buffer（Mg2+Free）.The Primers PR710 annealing temperature is 59.6 ℃，which proves that the system has good practicability.

Key words： P.micranthum； orthogonal design； SSRendprint