重金属胁迫对任豆种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响

， ， ， ， (河池学院化学与生物工程学院， 广西 宜州 546300)

重金属胁迫对任豆种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响

覃勇荣，汤丰瑜，严海杰，白新高，刘旭辉
(河池学院化学与生物工程学院， 广西 宜州 546300)

为了解任豆幼苗的重金属耐性，探讨利用其进行重金属污染土壤修复的可行性，以尾矿、泥土及菌糠作为栽培基质的原料，在人工模拟重金属胁迫的条件下，对任豆种子进行了发芽试验，并测定了在不同重金属胁迫背景下任豆幼苗的SOD、POD和CAT活性。结果表明：任豆种子可以在含有重金属的栽培基质中萌发，但萌发率较低；在尾矿、泥土及菌糠3种原料适当比例混合的栽培基质中，任豆种子的萌发率相对较高；不同重金属对任豆幼苗抗氧化酶活性的影响不同，在低浓度的重金属离子胁迫下，任豆幼苗的SOD、POD和CAT活性均有不同程度升高，在高浓度的重金属离子胁迫下，其SOD、POD和CAT活性则逐渐降低；不同重金属对任豆幼苗抗氧化酶活性影响的大小排序为Cd2+gt;Cu2+gt;Pd2+gt;Zn2+。任豆幼苗对不同重金属有不同的耐性，其大小排序为：Zn2+gt;Pd2+gt;Cu2+gt;Cd2+。根据任豆幼苗的重金属耐性，可将其用于土壤重金属污染的植物修复，但土壤中的重金属含量应不超出其耐受的范围。

重金属胁迫； 任豆种子； 幼苗； 抗氧化性酶活性

矿山开采及矿物资源开发利用，可以为社会提供丰富的物质产品，带来一定的经济利益，但也可能引发一系列严重的生态环境问题[1-2]。长期以来，由于观念滞后、技术落后、资金不足、人才缺乏等原因，一些地方企业在矿物开采及加工利用的过程中，资源浪费严重，污染问题突出，对周边环境造成了严重的影响，甚至成为引发社会矛盾和冲突的重要根源[3-4]。因此，保护生态环境，提高矿物资源的综合利用效率，转变经济增长方式，对增强可持续发展能力具有重要的意义。

广西是有色金属之乡，其西北部的南丹县被称作为“矿物学家的天堂”。但是，由于诸多原因，在广西的部分地区，有些矿山没有自己的石排场和尾矿库，因此直接将大量的尾矿堆积在山上，不仅占用了大量的土地，而且影响其所在区域及周边植被的生长，更为严重的是，在暴雨期间很容易造成泥石流灾害，尾矿中的有害物质(酸性废水及重金属元素)，还会伴随雨水和地表径流汇入江河，严重污染周边的环境[5]。这就是广西有色金属矿区多次发生重金属污染事件的原因。

在土壤重金属污染修复的实践中，人们曾尝试使用多种不同的方法，并取得了一些理论研究成果和实践经验[1]。因为生物修复具有成本低廉，技术简便，适用范围广，不会产生二次污染等优点，所以，越来越受到人们的青睐[6]。任豆是我国特有单种属植物，主要分布于南方各省区的石灰岩地带，因其根系发达，抗旱能力较强，生长迅速，生态经济效益较高，因而被广泛应用于岩溶地区造林绿化和石漠化治理过程中。有人曾对土壤重金属污染背景下的任豆修复进行试验，并测定了任豆幼苗的部分抗性生理指标[7-8]。但迄今为止，利用任豆对岩溶地区土壤重金属污染进行修复的系统研究未见报道。

相关的研究结果表明，植物的抗氧化酶活性与抗逆性有关[9-10]。在正常情况下，植物可通过抗氧化酶系统(如SOD、POD、CAT等)的协同作用，维持自由基在体内的动态平衡[11]。当植物受到干旱、高温、盐度过高等不利环境因子的影响时，其体内的活性氧代谢会出现失衡状态[12]。在重金属离子的胁迫下，植物会产生过量的活性氧(如超氧阴离子、过氧化自由基等)，使植物的细胞膜脂质过氧化，蛋白质、酶等功能物质严重损伤而死亡[13]。本研究根据广西南丹县大厂尾矿坝的重金属背景，模拟不同浓度重金属Cu2+、Pd2+、Cd2+、Zn2+胁迫条件，对任豆幼苗进行盆栽试验，了解不同重金属胁迫对任豆种子发芽率及其幼苗抗氧化酶活性的影响，分析和检验任豆幼苗的重金属耐性，以便为土壤重金属污染的植物修复及优良先锋树种的筛选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 任豆种子

实验所用的任豆种子，2016年3月从昆明美地苗木育种有限公司网购。

1.1.2 栽培基质

栽培基质原料分别为：尾矿样品，泥土，以及食用菌栽培后的废弃物——菌糠。其中，尾矿样品采自广西南丹县大厂长坡尾矿坝，泥土采自河池学院东校区图书馆背面马路与宜州市白龙公园围墙之间的农地，菌糠采自河池学院食用菌栽培研究室。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试 剂

实验研究所用的药品和试剂见表1，所有药品均为分析纯(AR)。

表1 实验使用试剂一览表

药品名称 生产厂家浓盐酸、浓硝酸、EDTA⁃Na、30%过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠西陇化工股份有限公司愈创木酚天津市光复精细化工研究所甲硫氨酸、核黄素、氮蓝四唑国药集团化学试剂有限公司

1.2.2 仪 器

本实验研究所用的主要仪器见表2。

表2 实验使用仪器一览表

仪器名称(型号) 生产厂家MP200A电子分析天平上海精密科学仪器有限公司华烨HYP⁃1040型消化炉上海纤检仪器有限公司UV⁃1800紫外可见分光光度计SHIMADZUCORPORATIONZEEnit9009原子吸收光谱仪德国耶拿分析仪器股份有限公司DHG⁃9070A电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司FT102微型土壤粉碎机、FT102微型植物粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司无菌超净台苏州苏洁净化设备公司SPX⁃150生化培养箱上海跃进医疗器械有限公司

1.3 实验方法

1.3.1 任豆种子外形检测

为了尽量减少因选种不当而造成的低发芽率问题，试验前，首先按常规方法筛选种子，去除不饱满、畸形、破损或者被虫蛀的任豆种子，使其外形完好率达到99.5%以上。然后，随机选取10粒外表形态正常的任豆种子，用游标卡尺分别测量出其长度、宽度及厚度，并做好相关的数据记录。

1.3.2 栽培基质原料的处理

将采集回来的栽培基质原料(尾矿、泥土和菌糠)自然风干，分别用干净的尼龙袋分装，置阴凉干燥处保存备用。避免接触水分、化学药剂或者被雨水淋洗。

1.3.3 任豆种子的发芽及盆栽试验

用小塑料盆作为栽培基质的容器，不同基质原料的配比见表3。准确称取不同质量的栽培基质原料，按设定的比例混合均匀，每盆风干的栽培基质总量为1.25 kg[8]。

表3 任豆幼苗栽培基质的原料配比一览表

编号原料配比T∶SMR∶TS∶MRT∶MR∶S10∶50∶50∶51∶1∶321∶41∶41∶41∶2∶232∶32∶32∶31∶3∶143∶23∶23∶22∶1∶254∶14∶14∶12∶2∶165∶05∶05∶03∶1∶1

注：不同栽培基质原料配比中，“T”、“S”和“MR”分别指“尾矿”、“泥土”和“菌糠”。下同。

选取大小均一、外表完好无损、颗粒饱满的任豆种子，先用60～70 ℃的热水进行催芽处理，每盆30粒种子，均匀点播到按表3方法配制好的栽培基质中。定期用去离子水喷洒，保持基质湿润，每天观察任豆种子的发芽情况，并做好相应的记录。待任豆幼苗长出后，按常规的方法对其进行日常管理。

1.3.4 栽培基质原料的重金属含量测定

分别将经过风干后的栽培基质原料(尾矿、泥土和菌糠)碾碎，过100目标准筛，用塑料封口袋封装，置阴凉干燥处保存备用。然后，用反王水消化—原子吸收光谱法，测定其重金属元素的含量[14]。

1.3.5 任豆幼苗抗氧化酶活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)的测定用氮蓝四唑法，过氧化物酶(POD)的测定用愈创木酚显色法，过氧化氢酶(CAT)的测定用紫外分光光度法[15]。

1.4 数据处理

所有实验均做3次重复，结果取平均值。实验数据处理及相关分析采用Excel 2010软件进行，绘图用Origin Pro 7.5 软件进行。实验结果的测定数据用平均值±标准误(Mean±SE)表示，栽培基质中的重金属含量数值，根据其不同原料配比及原料中的重金属含量换算。

2 结果与分析

2.1 任豆种子在不同栽培基质的萌发情况

任豆种子外形的检测结果见表4，栽培基质原料中的重金属含量测定结果见表5，任豆种子在不同栽培基质中的萌发情况见图1和图2。

表4 任豆种子外形测定数据一览表(单位：mm)

编号长度宽度厚度15．80±0．345．37±0．231．84±0．1826．10±0．245．25±0．231．76±0．1336．08±0．275．48±0．251．86±0．14平均值5．99±0．175．37±0．121．82±0．05

注：分别随机抽取10粒种子进行分组编号，每组中的相应数据均为同组10粒种子测量数据的平均值。

表5 任豆栽培基质原料的重金属含量(单位：mg/kg)

样品Zn2+Cu2+Pb2+Cd2+泥土427．08±10．4140．44±0．45125．81±14．66—尾矿19180．5±110．93504．45±4．853278．63±29．28141．7±4．34菌糠66．96±5．7516．51±1．98——

注：“—”表示送检样品中相应的重金属含量低，仪器未检出。

图1 任豆种子在2种原料不同比例混合基质中的发芽率

图2 任豆种子在3种原料不同比例混合基质中的发芽率

由图1可以看出，在尾矿、泥土、菌糠三者不同比例两两混合而成的栽培基质中，任豆种子的发芽率都比较低，但单独以泥土、菌糠或尾矿作为基质时，任豆种子的发芽率相对较高(达到70.00%～80.00%)；当泥土与菌糠以3∶2的比例混合时，任豆种子的萌发率也达到70%，其余各种栽培基质中任豆种子的萌发率均小于50%(最低只有31.10%)。从图2可以看出，将尾矿、泥土及菌糠三者混合作为栽培基质时，任豆种子的发芽率则明显高于上述3种原料两两混合的栽培基质。

图3 Cu2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+胁迫下任豆幼苗SOD活性的变化

2.2 重金属胁迫对任豆幼苗抗氧化酶活性的影响

2.2.1 重金属胁迫对任豆幼苗SOD活性的影响

不同重金属胁迫对任豆幼苗SOD活性影响的结果见图3。由图3可看出，在不同浓度的重金属Cu2+、Cd2+、Pd2+、Zn2+胁迫下，SOD活性均呈现先升高后降低的变化趋势；任豆幼苗对重金属Cu2+、Cd2+的胁迫极其敏感，且耐受的浓度范围非常有限，在低浓度的重金属胁迫下，其SOD活性随着重金属浓度的增加而快速增加，当重金属Cu2+和Cd2+浓度分别为406.71 mg/kg和85.04 mg/kg时，其SOD活性达到最大值，之后，随着重金属浓度的增加，SOD活性急剧下降；在低浓度重金属Pd2+和Zn2+的胁迫下，其SOD活性呈缓慢上升趋势，当重金属Pd2+、Zn2+达到较高浓度时(2 000 mg/kg和15 000 mg/kg)，其SOD活性急剧下降。说明任豆幼苗对不同重金属胁迫的耐性不同，通常是随着重金属的浓度的增大，其SOD活性逐渐增加，当重金属浓度超出其耐受范围时，SOD活性受到抑制而急剧下降。

2.2.2 重金属胁迫对任豆幼苗POD活性的影响

不同重金属胁迫对任豆幼苗POD活性影响的结果见图4。由图4可知，不同重金属对任豆幼苗的POD活性影响不同，任豆幼苗对重金属浓度有一定的耐受范围。在低浓度的重金属Cu2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+胁迫下，任豆幼苗POD活性有上升的趋势，但上升的幅度有差异；当重金属Cu2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+浓度超过一定值时，任豆幼苗的POD活性则开始逐渐下降；当Cu2+浓度为 211.61 mg/kg时，任豆幼苗的POD活性达到最大值，而当Pd2+浓度为8 000 mg/kg时，任豆幼苗的POD活性才达到最大值。重金属Cu2+和Cd2+胁迫对任豆幼苗POD活性影响较大，而重金属Pd2+和Zn2+胁迫对任豆幼苗POD活性的影响则相对较小。

2.2.3 重金属胁迫对任豆幼苗CAT活性的影响

不同重金属胁迫对任豆幼苗CAT活性影响的结果见图5。由图5可看出，在低浓度的重金属Cu2+、Cd2+、Pd2+、Zn2+胁迫下，任豆幼苗的CAT活性呈逐渐上升的趋势，但重金属Cu2+、Cd2+、Zn2+超过一定浓度之后，任豆幼苗的CAT活性急剧下降。从盆栽试验结果来看，在相同浓度的情况下，任豆幼苗对重金属Pd2+和Zn2+耐受能力较强，受害程度相对较轻，而对Cu2+和Cd2+的胁迫则比较敏感，耐受能力较差，受害程度比较严重。

图4 Cu2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+胁迫下任豆幼苗POD活性的变化

图5 Cu2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+胁迫下任豆幼苗CAT活性的变化

3 讨 论

相关研究结果表明，SOD是生物体内抗氧化酶系统中一种极为重要的酶，在保护酶系中处于核心地位，能够专一性地清除生物氧化过程中产生的超氧化物自由基，可催化超氧阴离子快速歧化成H2O2和O2，以解除自由基氧化过程中产生的有害成分对有机体造成的伤害。POD 广泛存在于植物体中，与植物的多种生理过程密切相关，是活性较高的一种酶，对植物代谢过程中产生的过量H2O2有清除作用，从而使植物细胞免受毒害[16]。CAT是一种酶类清除剂，是生物防御体系的关键酶之一，能够催化H2O2分解为H2O和O2,使细胞免受毒害，维持活性氧代谢的平衡，保护细胞膜的完整性[17]。

高浓度的重金属Cu2+、Cd2+、Pd2+、Zn2+对生物有明显的毒害作用。在重金属的胁迫下，植物体内启动了一系列应激反应，SOD、POD和CAT等多种酶被激活，其合成与运转交替进行，活性迅速增强。抗氧化酶能够利用氧化还原作用，将体内的过氧化物转换为无害的物质，从而减少重金属对植物造成的伤害。但是，如果重金属胁迫的浓度过高，超出了植物的耐受范围，就会对抗氧化酶系统的功能产生抑制作用，使抗氧化酶活性迅速降低，并使植物受到严重伤害，甚至死亡[18]。

通过对不同重金属胁迫下任豆种子的发芽率及幼苗抗氧化酶活性的差异比较，结果发现，将尾矿、泥土及菌糠三者混合作为栽培基质时，任豆种子的发芽率较高。其原因可能是这种混合基质具有较好的透气性和更强的保水能力，同时，由于菌糠与泥土的添加，不仅改善了栽培基质的物理特性，还降低了重金属离子的浓度，因而更有利于种子的萌发。在重金属胁迫下，任豆幼苗的抗氧化酶活性不仅与重金属元素种类有关，而且还与重金属离子的浓度有关。植物对重金属胁迫等不利因子的抗性，实际上是其体内各种抗氧化酶活性相互协调、综合作用的结果[19]。从实验结果中可以看出，任豆幼苗对Pd2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+等4种重金属的耐性有明显的差异。也就是说，在栽培基质中，使任豆幼苗SOD、POD和CAT活性下降的Cu2+、Cd2+、Zn2+和Pd2+浓度是有明显差异的。任豆幼苗耐受的重金属离子浓度大小排序为：Zn2+gt;Pd2+gt;Cu2+gt;Cd2+，这与笔者先前的实验结果不完全一致[7-8]。其原因可能是先前的试验是土培和水培试验，种子来源不同；而现在做的试验是尾矿+泥土+菌糠混合基质的盆栽试验，两者情况有一定的差异。在混合基质中，虽然重金属的含量比较高，但其有效态不一定很高，重金属离子与任豆幼苗根部的接触机会也比水培试验少一些。相关问题，有待日后进一步研究。

4 结 论

1) 任豆种子可以在含有重金属的栽培基质中萌发，但萌发率较低；在尾矿、泥土及菌糠3种原料适当比例混合的栽培基质中，任豆种子的萌发率相对比较高。

2) 不同重金属对任豆幼苗抗氧化酶活性的影响不同。在低浓度的重金属离子胁迫下，任豆幼苗的SOD、POD、CAT活性升高，在高浓度的重金属离子胁迫下，任豆幼苗的SOD、POD、CAT均有不同程度活性降低。不同重金属对任豆幼苗抗氧化酶活性影响的大小排序为： Cd2+gt; Cu2+gt; Pd2+gt; Zn2+。

3) 任豆幼苗对不同重金属胁迫有不同的耐性，其耐受能力大小排序为：Zn2+gt;Pd2+gt;Cu2+gt;Cd2+。根据任豆幼苗的重金属耐性，可将其用于土壤重金属污染的植物修复。

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Effects of Heavy Metal Stress on Seed Germination and Seedlings Antioxidant Enzyme Activity ofZeniainsigni

QINYongrong,TANGFengyu,YANHaijie,BAIXin’gao,LIUXuhui
(School of Chemistry and Biological Engineering,Hechi University,Yizhou Guangxi 546300,China)

In order to understand the heavy metal tolerance ofZeniainsigniseedlings,to discuss the feasibility of heavy metal contaminated soil remediation with the seedlings.Tailing,soil,cultural residue of edible fungi was used as the raw material of cultivation substrate,germination test ofZ.insigniseeds were conducted under the condition of artificial simulation of the heavy metal stress, the activities of SOD,POD and CAT were determined by the authors.The results showed that althoughZ.insigniseeds could germinate in the cultivation substrate containing heavy metals,and the germination rate was low.But the germination rate of the seeds was relatively high,when they were sown in mixed cultivation matrix which mixed with tailing,cultural residue of edible fungi and soil with appropriate proportion.The effects of different heavy metals on antioxidant enzyme activities ofZ.insignisseedlings were different.Under the stress of low concentration of heavy metal ions,the activity of SOD,POD,CAT had certain degree increase.While,under the stress of high concentration of heavy metal ions,the activity of SOD,POD,CAT reduced gradually.The influences of different heavy metals on antioxidant enzyme activities ofZ.insignisseedlings were different,the order were as follows:Cd2+gt;Cu2+gt;Pd2+gt;Zn2+.It shown thatZ.insignisseedlings had different heavy metal tolerance,the order were as follows:Zn2+gt;Pd2+gt;Cu2+gt;Cd2+.Based on the tolerance ofZ.insignisseedlings,it might be considered to use as the tolerance plant in soil remediation of heavy metal pollution.But the heavy metal content in the soil should not exceed the range of its tolerance.

heavy metal stress;Zeniainsignisseed;Zeniainsignisseedlings; antioxidant enzymes activity

2017-04-26

广西自然科学基金重点项目(2012 GXNSFDA 053023)；校地校企共建高校科技创新平台(桂教科研2012[9]号)；广西高校重点实验室(桂教科研2010[6]号)。

覃勇荣(1963—)，男，广西平南人，教授，主要从事桂西北岩溶地区土壤重金属污染治理及生态修复问题研究。

刘旭辉(1962—)，女，四川武胜人，教授，主要从事环境化学分析及重金属污染问题研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.10.031

X 171.5； Q 945.78

A

1001-4705(2017)10-0031-06