麻杏石甘汤对哮喘大鼠气道上皮细胞粘蛋白表达的影响研究

虞琳+潘建伟

摘要：目的 研究麻杏石甘汤对哮喘大鼠气道上皮细胞粘蛋白表达的影响，探讨其在哮喘粘液高分泌中的作用。方法 将44只SPF级雄性SD大鼠随机分为四组，对照组（A组），哮喘组（B组），哮喘+布地奈德组（C组），哮喘+麻杏石甘汤组（D组）。留取支气管肺泡灌洗液（BALF）检测其中IL-12、IL-13的浓度；切取肺组织标本行HE染色观察气道炎症，AB-PAS法检测各组大鼠气道粘蛋白的表达，检测吸光度值后运用SPSS17.0进行统计。结果 ①麻杏石甘汤能降低哮喘组BALF中IL-13浓度，上调IL-12含量；②麻杏石甘汤能减轻哮喘大鼠气道及血管肌层增生情况，减少周围炎性细胞浸；③哮喘组存在气道粘液高分泌，麻杏石甘汤能下调气道粘蛋白的表达，但作用较布地奈德组弱。结论 麻杏石甘汤可减少粘蛋白表达，减轻哮喘大鼠炎症反应、气道粘液高分泌，为其在哮喘的现代临床应用提供依据。

关键词：麻杏石甘汤；哮喘；布地奈德；粘蛋白

中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）23-0086-04

Effect of Maxingshigang Decoction on Expression of Mucin in Airway Epithelial Cells of Asthmatic Rats

YU Lin，PAN Jian-wei

（Department of Pediatrics，the Fourth Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University，Yiwu 322000，Zhejiang，China）

Abstract：Objective To study the effect of Maxingshigan decoction on expression of airway epithelial cell mucin in asthmatic rats and explore its role in mucus hypersecretion in asthma.Methods 44 male SD SPF rats were randomly divided into 4 groups，the control group（A group），asthma group（B group），Asthma+budesonide group（C group），asthma+apricot stone group（D group）.Take the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）to detect the IL-12，IL-13 concentration；cut the lung tissue HE staining observation of airway inflammation，examined the expression of rat airway mucin AB-PAS method， detecting the absorbance after using SPSS17.0 statistics.Results ① Maxingshigan decoction could decrease the concentration of IL-13 in BALF of asthmatic group and up-regulate the content of IL-12.② Maxingshigan decoction can reduce the airway and vascular myometrial hyperplasia of asthmatic rats，reduce the surrounding inflammatory cell leaching.③ Asthmatic group had a high secretion of airway mucus，and Maxingshigan decoction could down-regulate the expression of airway mucin，but the effect was weaker than that of budesonide group.Conclusion Maxingshigan decoction can reduce the expression of mucin，reduce the inflammatory reaction and airway mucus secretion in asthmatic rats，and provide the basis for its clinical application in asthma.

Key words：Maxingshigan decoction；Asthma；Budesonide；Mucin

支气管哮喘（简称哮喘，bronchial asthma）是儿童时期最常见的慢性疾病之一[1]，发病率逐年攀升，其发病与气道慢性炎症、气道高反应（airway hyperresponsiveness，AHR）、气道重塑、粘液高分泌等密切相关。过度的气道粘液分泌提示哮喘控制不佳，是许多哮喘患兒的共同临床特点，已经成为影响哮喘病情和预后的独立危险因素，但在哮喘发病中的作用往往被忽视[2]。减少粘液分泌、促进粘液排出是哮喘防治亟待解决的重要课题。麻杏石甘汤出自经典国方《伤寒论》，由麻黄、杏仁、炙甘草、石膏四味药组成，是治疗热哮的良方。现代药理学研究表明其具有解热平喘、镇咳祛痰、抗炎、抗过敏的功效[3]。但其在哮喘防治中的具体机制仍未阐明，对哮喘气道粘液分泌的影响更是鲜有报道。因此，本研究拟通过建立哮喘大鼠模型，采用AB-PAS染色法等研究气道粘蛋白表达，探讨麻杏石甘汤在哮喘粘液高分泌中的作用。endprint

1材料与方法

1.1药物及试剂

卵清白蛋白（ovalbumini，OVA）、焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）购自美国Sigma公司，吸入用布地奈德混悬液来自阿斯利康公司，大鼠IL-12、IL-13、ELISA试剂盒来自美国R&D公司，AB-PAS染色试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，其余试剂为市售分析纯试剂。实验过程均遵从学校实验动物正规流程审批、购买、饲养，本文作者在实验前已通过本省实验动物相关培训。

1.2 麻杏石甘汤的制备

麻黄6 g，杏仁6 g，甘草5 g，石膏20 g，煎制根据国家中医药管理局颁布的《医疗机构中药煎药室管理规范》。先将石膏煮20 min，后将浸泡30 min的麻黄、杏仁及甘草放入同煎15 min，倒取第一道汁待用。在剩余药渣中加入双倍双蒸水，再次煎煮15 min后取汁，第一、二道汁混合后采用蒸发法浓缩至相应体积。最后获得含生药12.3 g/kg的麻杏石甘汤，储存于4℃冰箱备用。

1.3实验动物分组及处理

44只幼年雄性SD大鼠，SPF级（购自温州医科大学实验动物中心），重120～180 g，采用数字编号法随机分为；四组，每组11只：对照组（A组）、哮喘组（B组）、哮喘+布地奈德组（C组），哮喘+麻杏石甘汤组（D组）。通过致敏和激发两阶段制作哮喘模型。致敏阶段：混合卵含白蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶制成无菌抗原液，分别于第1 d和第8 d注射B组大鼠， A组则用等量的生理盐水替代。激发阶段：第2次致敏1 w后， 将B-D组哮喘大鼠放入40×30×20 cm3的自制密闭玻璃箱中， 雾化吸入含1%OVA的生理盐水，定时1次/d，30 min/次，连续激发3 d；A组同样用生理盐水代替OVA进行。C组大鼠在第2次致敏后的第4 d开始予布地奈德混悬液2 ml+生理盐水2 ml雾化，2次/d；每次激发前后4 h再次布地奈德雾化。D组在第2次致敏后第4 d起予之前制备的麻杏石甘汤灌胃，2次/d，激发阶段则在每次激发前后4 h采用灌胃针灌入麻杏石甘汤。

1.4 标本的制备

末次激发24 h后，予腹腔注射3 ml/kg 10%水合氯醛镇静，固定大鼠，切开腹主动脉取血处死。即刻切开气管，结扎、切取左肺置入液氮保温杯中，后经过脱水、石蜡包埋、切片等处理。肺组织切片行HE染色、AB-PAS染色。气管插管后行右肺灌洗术，每次灌洗后回收70%以上支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid， BALF）为合格。2000 rpm/min离心15 min， 取上清-80 ℃保存备用。

1.5 BALF中IL-12 和IL-13浓度测定

应用sandwich ELISA法检测BALF中IL-12、IL-13的浓度。具体实验过程参考试剂说明书进行。

1.6 AB-PAS法检测气道粘蛋白表达

石蜡切片脱蜡至水，3%醋酸水溶液室温1 min， 1%Alcian blue染色液染色15 min，蒸馏水洗后1%过碘酸氧化8 min，Schiff染色12 min，水洗后脱水封片。硫酸化粘液呈黑色，酸性粘液呈兰色，中性粘液呈红色。采用图像分析仪测定软件测取肺组织粘蛋白平均吸光度值作为粘蛋白定量测定量。

1.7 统计学方法

统计分析软件为SPSS17.0，所有数据均进行正态性检验，并以（x±s）表示。多组样本均数比较采用方差分析（One-way ANOVA），方差齐者两两比较采用LSD检验，方差不齐者采用Tamhane's T2检验。

2结果

2.1哮喘模型的生物学判断

OVA雾化激发时，哮喘组大鼠可见毛色失去光泽、躁动不安、呼吸急促、四肢抖动，严重者四肢瘫软，俯伏不动，呼吸节律欠规则。麻杏石甘汤及布地奈德组大鼠激发后表现较哮喘组有改善。

2.2大鼠BALF中IL-12、IL-13

与对照组相比，哮喘组BALF中IL-13浓度显著升高，IL-12浓度下降。布地奈德、麻杏石甘汤均能降低哮喘组BALF中IL-13浓度，上调IL-12含量，差异有统计学意义（P<0.05），且布地奈德作用强于麻杏石甘汤，见图1。

图1 各组哮喘大鼠BALF中IL-12、IL-13的浓度

2.3 大鼠肺组织病理改变

正常组大鼠气道、血管形态规整，未见明显炎性细胞浸润。哮喘组气道、血管肌层明显增生，部分气道上皮脱落，管腔内可见粘液栓，气道周围嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润明显。C、D组大鼠肺组织炎性细胞浸润、血管平滑肌增生、粘液栓形成均较B组减轻，见图2。

2.4 麻杏石甘汤调控气道粘蛋白的表达

运用AB-PAS染色法发现，粘蛋白主要表达于气道上皮细胞，尤以大气道为著。B组粘蛋白表达（吸光度值：87.94±28.13）较A组（21.57±10.25）明显增多（P<0.01），麻杏石甘汤（57.71±22.45）干预后能明显减少哮喘大鼠气道上皮粘蛋白的表达（P<0.5），但较布地奈德组（46.83±17.41）表达仍有增多，见图3。

3讨论

Th（T helper cell，辅助性T淋巴细胞）1/Th2失衡被公认为是哮喘发病的重要免疫学机制[4]。Th1和Th2分泌的细胞因子在促进自身亚型的分化同时，对另一细胞亚型起着抑制作用。研究发现，Th2细胞因子IL-4、IL-13等的优势表达，可进一步诱导趋化因子介导肺部炎症，诱导分泌IgE（immunglobulin E，免疫球蛋白E），促進粘液高分泌，加重AHR，还可直接刺激成纤维细胞参与气道重塑，在哮喘发病中起着独特而重要的作用[5]。本实验中，哮喘组大鼠BALF中Th2细胞因子IL-13浓度明显升高，Th1细胞因子IL-12浓度下调，证实与正常大鼠相比，哮喘大鼠存在Th1/Th2比例失衡，与文献报道一致[4， 6]。进一步对哮喘大鼠肺组织切片行HE染色可见气道平滑肌及血管肌层明显增生，部分气道上皮细胞损伤、脱落，周围大量炎性细胞（嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞）浸润，提示哮喘状态时气道炎症明显，本研究中哮喘模型复制成功。endprint

气道上皮细胞是气道结构细胞，表面覆盖以气道粘液作为物理屏障，粘液分泌的稳态性对气道的粘膜纤毛和固有免疫起着屏障、湿润、运输、免疫的作用。病理状态下，过度的粘液分泌可降低粘膜纤毛清除率和限制气流，导致气道阻塞、气流受损、肺功能进行性下降、细菌感染机会增加等。与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相比，哮喘患者的气道粘液更为粘稠，易产生凝胶状的粘液栓并可能阻塞气道[7]。过量的粘液产生是哮喘患者，特别是重症患者发病与死亡率增加的主要原因，但其机制尚不清楚[8]。粘蛋白是粘液中的主要蛋白成分，是一种高度糖基化的蛋白质，由气道上皮杯状细胞和黏膜下层的黏液细胞分泌，其编码基因为粘蛋白基因（MUC）。在人类气道内主要的分泌型粘蛋白为MUC5AC和MUC5B， 其中MUC5AC 水平高低代表了杯状细胞增生的程度。本实验运用AB-PAS法染色发现，各组大鼠粘蛋白均表达于气道上皮细胞，其中哮喘大鼠气道上皮粘蛋白表达明显增多，证实哮喘病理状态时存在气道粘液高分泌，这与国外学者研究一致[9]。但本研究并未能从MUC5AC、MUC5B等基因层面进一步深入探究。另外，Suzaki I等[10]报道IL-13处理后杯状细胞含量能增加10倍，认为IL-13能够刺激杯状细胞化生、粘蛋白形成。Tyner JW等[11]也发现，当用IL-13干预气-液交界面的小鼠气道上皮细胞时，能诱导纤毛细胞向杯状细胞化生。本研究中，哮喘大鼠IL-13和粘蛋白表达亦均有升高，两者之间是否存在相关性及具体机制还有待进一步研究。

吸入性糖皮质激素（ICS）是哮喘长期控制的首选药物，可有效控制哮喘症状、改善生命质量、改善肺功能、减轻气道炎症和气道高反应性、减少哮喘发作、降低哮喘死亡率[12-13]。布地奈德雾化吸入作为哮喘防治的一线经典用药，可通过细胞内受体的基因组机制和细胞膜的非基因组机制起作用[14]，循证医学表明布地奈德治疗哮喘急性发作起效迅速，可在40min内产生明显的气道血管收缩作用，从而抑制气道壁的水肿及血浆渗漏[15]，因此，本研究中将布地奈德雾化吸入作为阳性药物对照组。本实验可见，与哮喘组相比，布地奈德雾化后能明显下调大鼠BALF中IL-13的浓度，减轻气道炎症反应，减少气道上皮细胞粘蛋白表达，提示布地奈德可改善哮喘气道炎症及粘液高分泌状态。

中医药学历史悠久，大量实验研究已证实某些中草药具有抗炎、抗过敏及免疫调节作用，中西医联合治疗在儿童哮喘防治中的作用受到越来越多的关注，2016版儿童哮喘指南已将中药列入治疗方案[16]。中医认为，痰饮留伏是哮喘发生的内在因素，麻杏石甘汤具有辛凉宣肺、清热平喘的功效，在临床中的应用已久。现代药理学研究证实麻杏石甘汤中麻黄所含的麻黄碱为β2受体激动剂，可活化腺苷酸环化酶（cAMP）、舒张支气管平滑肌痉挛；苦杏仁苷是杏仁中所含的成分，经酶水解后产生氢氰酸，可有止咳平喘作用，并能促进动脉壁前列腺I2（PGI2）样物质生成，扩张微血管，改善微循环；生石膏的成分主要为含水硫酸钙，可抑制及镇静支气管神经肌肉，且钙质能降低支气管通透性，故有解除支气管痉挛的作用[17]。本研究发现麻杏石甘汤可减少哮喘大鼠嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润，下调BALF中Th2细胞因子IL-13的浓度，减轻变态反应。运用AB-PAS染色法发现，麻杏石甘汤灌胃干预哮喘大鼠后，其气道上皮细胞粘蛋白的分泌亦明显减少。国内也有学者报道[18]麻杏石甘汤可降低小鼠BALF中MUC5AC浓度，提示麻杏石甘汤在改善哮喘粘液高分泌方面具有一定的作用。但是，我们也看到，与阳性药物对照组布地奈德雾化吸入比较，麻杏石甘汤在减轻肺组织炎症、减少气道粘蛋白分泌方面仍有一定差距，提示单独药物治疗哮喘时仍应以ICS为主，麻杏石甘汤可作为辅助用药协同参与哮喘防治。

综上所述，本实验证实麻杏石甘汤能减少哮喘大鼠Th2细胞因子IL-13、气道炎症及粘蛋白的表达，减轻炎症反应，减少粘液高分泌，为其现代临床应用提供了依据。进一步深入研究具体信号通路及相关炎症因子，临床麻杏石甘汤片剂的研制等，将为哮喘的中西医结合治疗开辟新的途径。

参考文献：

[1]洪建国，鲍一笑.重视儿童支气管哮喘的规范化诊治[J].中华儿科杂志，2016，54（3）：161-162.

[2]Takami S，Mizuno T，Oyanagi T，et al.Glucocorticoids inhibit MUC5AC production induced by transforming growth factor-alpha in human respiratory cells[J].Allergol Int，2012，61（3）：451-459.

[3]洪佳璇，楊季国.麻杏石甘汤的临床应用及研究概况[J].中国急救医学，2015（z1）：122-123.

[4]Hwang Y H，Paik M J，Yee S T.Diisononyl phthalate induces asthma via modulation of Th1 Th2 equilibrium[J].Toxicol Lett，2017（272）：49-59.

[5]Gallelli L，Busceti M T，Vatrella A，et al.Update on anticytokine treatment for asthma[J].Biomed Res Int，2013，2013：104315.

[6]Xiong L，Fang Z Y，Tao X N，et al.Effect and mechanism of ligustrazine on Th1 Th2 cytokines in a rat asthma model[J].Am J Chin Med，2007，35（6）：1011-1020.endprint

[7]Tillie-Leblond I，Gosset P，Tonnel A B.Inflammatory events in severe acute asthma[J].Allergy，2005，60（1）：23-29.

[8]Gras D，Chanez P，Vachier I，et al.Bronchial epithelium as a target for innovative treatments in asthma[J].Pharmacol Ther，2013，140（3）：290-305.

[9]Lachowicz-Scroggins M E，Yuan S，Kerr S C，et al.Abnormalities in MUC5AC and MUC5B Protein in Airway Mucus in Asthma[J].Am J Respir Crit Care Med，2016，194（10）：1296-1299.

[10]Suzaki I，Kawano S，Komiya K，et al.Inhibition of IL-13-induced periostin in airway epithelium attenuates cellular protein expression of MUC5AC[J].Respirology，2017，22（1）：93-100.

[11]Tyner J W，Kim E Y，Ide K，et al.Blocking airway mucous cell metaplasia by inhibiting EGFR antiapoptosis and IL-13 transdifferentiation signals[J].J Clin Invest，2006，116（2）：309-321.

[12]Bisgaard H，Le Roux P，Bjamer D，et al.Budesonide formoterol maintenance plus reliever therapy：a new strategy in pediatric asthma[J].Chest，2006，130（6）：1733-1743.

[13]Horak F，Doberer D，Eber E，et al.Diagnosis and management of asthma - Statement on the 2015 GINA Guidelines[J].Wien Klin Wochenschr，2016，128（15-16）：541-554.

[14]Alangari A A.Genomic and non-genomic actions of glucocorticoids in asthma[J].Ann Thorac Med，2010，5（3）：133-139.

[15]Price D B，Gefen E，Gopalan G，et al.Real-life effectiveness and safety of the inhalation suspension budesonide comparator vs the originator product for the treatment of patients with asthma： a historical cohort study using a US health claims database[J].Pragmat Obs Res，2017（8）：69-83.

[16]中華医学会儿科学分会呼吸学组，编辑委员会中华儿科杂志.儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）[J].中华儿科杂志，2016，54（3）：167-181.

[17]桑杲，陈志敏.麻杏石甘汤治疗小儿支气管哮喘的药理研究及临床应用进展[J].浙江中医杂志，2006，41（6）：366-368.

[18]孙雪文，王晓华，张志涛，等.麻杏石甘汤不同煎煮法对哮喘模型小鼠MUC5AC和HIF-1α的影响[J].天然产物研究与开发，2013，25（11）：1507-1509，1575.endprint