萱草花瓣中类胡萝卜素分析样品的制备及UPCC-MS检测方法研究

赵薪鑫 焦 芳 孙国峰 张金政*

(1.西北农林科技大学风景园林艺术学院，杨凌 712100； 2.中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室，北京 100093； 3.北京市花木有限公司，北京 100044)

萱草花瓣中类胡萝卜素分析样品的制备及UPCC-MS检测方法研究

赵薪鑫1,2焦 芳2,3孙国峰2张金政1,2*

(1.西北农林科技大学风景园林艺术学院，杨凌 712100；2.中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室，北京 100093；3.北京市花木有限公司，北京 100044)

以大苞萱草(HemerocallismiddendorfiiTrautv.et Mey.)和‘原谅’萱草(H.‘Pardon Me’)为研究对象，对萱草属植物花瓣中类胡萝卜素的样品制备方法以及UPCC-MS定性和定量检测方法进行了研究。结果表明：(1)萱草花瓣类胡萝卜素样品制备过程中，不同的提取试剂、振荡方法及皂化方法对类胡萝卜素的提取效率均有显著影响，经过对提取结果的方差分析，确定最佳的样品制备方案为：提取试剂B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)、温控摇床振荡提取，常温皂化16 h；(2)UPCC-MS技术能在10 min内高效分离萱草花瓣中的类胡萝卜素，且使用的有毒化学试剂少，是检测类胡萝卜素的较好选择；(3)大苞萱草和原谅萱草花瓣中共含有20种类胡萝卜素物质，两者颜色不同，类胡萝卜素的组成和含量也存在差异。

萱草；类胡萝卜素；样品制备方法；UPCC-MS

萱草属(Hemerocallis)植物是百合科(Liliaceae)多年生宿根草本花卉，具有适应性强、姿态优美、花色及花形丰富、花期长等特点，是庭园、花坛及街道绿化的理想花卉[1]。经过多年的杂交育种，现代萱草几乎具有除蓝色和黑色以外的全部颜色，但对其花色素的研究还较少[2～3]，对萱草花瓣中类胡萝卜素的研究有利于揭示萱草属植物花色的形成原因。

类胡萝卜素是由植物和一些微生物合成的脂溶性的天然色素[4]，广泛存在于植物的叶绿体和有色体膜上，绝大多数呈黄色、橙色和红色[5]。许多高等植物的果实和花瓣呈现出的黄色或橙色均源于存在于其细胞中的类胡萝卜素化合物[6]。同时，作为一种食用性色素，类胡萝卜素不仅具有很好的着色功能，在抗衰老、增强人体免疫力、防癌和抗癌、防辐射和预防心血管疾病等方面同样具有显著的生理活性[7～12]。而萱草属的很多种类如黄花菜(H.citrinaBaroni)、小黄花菜(H.minorMill.)、北黄花菜(H.lilioasphodelusL.)等可以作为食用蔬菜。因此，对萱草花中类胡萝卜素提取和检测方法的开发有利于对食用萱草的营养价值做更全面的评价。

天然类胡萝卜素的提取和检测方法的研究一直是类胡萝卜素研究的热点。同时，由于类胡萝卜素结构特殊、同分异构体较多，对其进行准确的检测也是研究难点。目前，检测类胡萝卜素最为常用的方法是高效液相色谱—质谱联用法(High performance liquid chromatography-Mass Spectrum，HPLC-MS)和超高效液相色谱—质谱联用法(Ultra performance liquid chromatography-Mass Spectrum，UPLC-MS)[13～17]，但这两种方法洗脱程序复杂，耗时较长，极易引起类胡萝卜素在分析过程中的降解，且洗脱过程需要消耗大量有机试剂，对环境污染较大。超高效合相色谱(Ultra performance convergence chromatography，UPCC)是一种融合了超临界流体色谱(Supercritical fluid chromatography，SFC)和UPLC优势的新的分离技术，使用UPCC分析类胡萝卜素具有如下优点：(1)UPCC所用流动相主要为超临界CO2，大大减少有毒试剂使用，绿色环保；(2)UPCC分析类胡萝卜素，大大减少了分析时间，从而减少样品在分析过程中的降解，使分析结果更加可靠；(3)UPCC对类胡萝卜素同分异构体有很好的分离效果；(4)UPCC检测提高了分辨率和检测的灵敏度，对于含量较低的类胡萝卜素也能检出。

目前，尚未有报道用UPCC的方法对萱草中类胡萝卜素进行检测分析。本研究以大苞萱草的花瓣为实验材料，采用UPCC-MS的方法进行检测，探究不同的提取试剂、振荡方法以及皂化方法对萱草花瓣中类胡萝卜素提取效果的影响，并获得从萱草花瓣中制备类胡萝卜素样品的最佳方法。再以大苞萱草和‘原谅’萱草花瓣作为橙黄色和红色两种花色的代表，分析不同颜色萱草花瓣中类胡萝卜素组成和含量的差别，为探究萱草属植物花色成因和全面评价萱草属植物的食用价值提供基础数据。

1 试验材料与分析方法

1.1 试材与取样

植物材料为新鲜的大苞萱草和‘原谅’萱草花瓣。试验所用大苞萱草和‘原谅’萱草均种植于中国科学院植物研究所萱草种质资源圃，以同样的栽培措施进行管理。在两种萱草开花盛期，于晴朗的早晨摘取完全开放的萱草花，将花瓣分离，洗净，然后放入-40℃冰箱中进行预冻。预冻后经真空冷冻干燥机干燥，加液氮研磨至均匀细粉，并放入干燥器中备用。

1.2 试验仪器与试剂

仪器包括：分光光度计(Metash UV-8000S)，超高效合相色谱—串联四级杆质谱联用仪(Waters ACQUITYTMUPCC-PDA，Xevo TQ MS)；氮吹仪(海能HN200)；磨样机(IKA A11 basic)、温控摇床(HS-200B)、低速离心机(京立，LD 4-1.8)。

试剂包括：色谱级β-胡萝卜素(β-carotene)标准品、色谱级叶黄素(lutein)标准品、色谱级玉米黄质(zeaxanthin)标准品；色谱级乙醇(ethanol)、色谱级叔丁基甲醚(MTBE)、色谱级2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)、超纯水、分析纯正己烷(n-hexane)、分析纯丙酮(acetone)、分析纯乙醚(diethyl ether)、分析纯氯化钠(NaCl)、分析纯氢氧化钾(KOH)。

1.3 类胡萝卜素的样品制备方法探究

1.3.1 类胡萝卜素样品制备步骤

根据相关参考文献[15,18～20]，对样品制备方法设置提取试剂、振荡方法和皂化方法三个因子。提取试剂有5种，分别为：A乙醇∶正己烷(4∶3/V∶V)；B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)；C乙醇∶丙酮∶正己烷(2∶1∶3/V∶V)；D乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)；E丙酮∶乙醇(1∶1/V∶V)。振荡方法有两种，分别为：A温控摇床震荡提取超声提取；B超声提取。皂化方法有两种，分别为：A室温下(20±5℃)温控摇床中皂化16 h；B温控摇床中55℃皂化1 h。样品制备方法探究一共20个组合，每个组合3次重复。整个制备过程在弱光环境中进行，具体步骤如下：

称取0.02 g研磨好的的大苞萱草花瓣细粉放入玻璃试管中，并加入适量的BHT作为抗氧化剂，防止类胡萝卜素在提取过程中被氧化，然后分别加入4 mL上述的提取剂，超声或温控摇床振荡提取10 min，之后再加入4 mL正己烷，同样超声或温控摇床振荡提取10 min。加入2 mL 10%的NaCl溶液后，在4℃条件下静置15 min，4 000 r·min-1离心10 min，收集溶液的上层有机相，下层水相加入正己烷：乙醚(3∶1/V∶V)溶液2 mL，超声或温控摇床振荡提取10 min后，4 000 r·min-1离心10 min，收集溶液的上层有机相。重复加入正己烷∶乙醚(3∶1/V∶V)溶液2 mL提取，至下层溶液无色，并合并收集的所有有机相。有机相用氮吹仪吹干，准备进行皂化反应。

皂化反应所用溶液为6%的KOH-甲醇溶液，分别用以上所述两种皂化方法进行皂化。皂化反应完成后，在皂化液中加入2 mL 10%的NaCl溶液，在4℃条件下静置15 min，再用正己烷∶乙醚(3∶1/V∶V)溶液重复超声或温控摇床振荡提取至下层溶液无色，得到最终的提取液，用氮吹仪吹干后用于仪器检测。

1.3.2 不同样品制备方法的提取效率比较

提取效率通过提取的类胡萝卜素总量来衡量。上述得到的干燥残渣用2 mL色谱级的正己烷溶解后，用Metash UV-8000S型分光光度计进行吸光度测试，以β-胡萝卜素标准品的浓度表示类胡萝卜素的总含量。

1.4 UPCC-PDA-TQ-MS法检测类胡萝卜素

利用分光光度计法选出来的最佳样品制备方法，按照1.3.1所述制备步骤提取类胡萝卜素用于UPCC-PDA-TQ-MS法的检测。进样前，干燥浓缩好的样品用2 mL的色谱级MTBE溶解，并过0.22 μm有机滤膜。通过对流动相种类和流动相梯度的优化，确定最终的色谱条件为：流动相A相为色谱级乙醇，B相为超临界CO2，检测时，流动相的流速为1.5 mL·min-1，选用色谱柱为ACQUITYTMUPCC HSS C18 SB柱(1.8 μm,3.0 nm×100 nm)，柱温为35℃，检测波长为440 nm，进样量1 μL，流动相梯度如下：0 min，5%B；5 min，20%B；7 min，20%B；8 min，5%B；10 min，5%B。质谱电离模式为APCI模式，质谱参数如下：锥孔电压4.0 kV，离子源温度150℃，探针温度450℃，氮气流速150 L·h-1，碰撞气体氩气的流速为0.15 mL·min-1，补偿液为0.1%甲酸—甲醇溶液，流速0.4 mL·min-1；数据的采集软件为MassLynx 4.1。

1.5 标准曲线制作及回收率试验

标准曲线制作时，β-carotene母液浓度为0.5 mg·mL-1，分别取母液4、8、12、16和20 μL，均稀释至200 μL；lutein母液浓度为1 mg·mL-1，分别取10、20、30、40和50 μL，稀释至100μL；zeaxanthin的母液浓度为1 mg·mL-1，分别取4、8、12、16和20 μL，然后稀释至200 μL。梯度溶液配置好后，依次进样，得到不同浓度标准溶液的色谱峰面积，再以标准品浓度为x轴，色谱峰面积为y轴建立拟合曲线，得到的线性方程即为各标准品的标准曲线(表1)。由于有些标准品无法从市场购得，所以没有标准品的物质通过结构类似物做半定量。此外，通过向样品中添加标准品(β-carotene、lutein和zeaxanthin，1 mg·mL-1，10 μL)的方法检验样品制备方法的回收率。

表1标准曲线方程、相关系数及回收率

Table1Standardcurveequation,correlationcoefficientandrecovery

标准品Standards标准曲线Standardcurveequationa相关系数R2b回收率Recoveryc(%)β-caroteney=189.79x-130110.991091.39luteiny=2463.9x-295290.995392.18zeaxanthiny=2800.3x-1937410.994893.20

注：a.回归方程y=kx+m；y. HPLC色谱峰面积；x.样品浓度(μg·mL-1)；b.R2表示回归方程的相关系数；c.回收率通过样品加标回收方法得到；回收率=(加标样品中物质的浓度—样品中物质的浓度)/所加标准品的浓度×100%

Notes：a.In standard curve equationy=kx+m；y.Represent peak area；x.Represent concentration of standards；b.Correlation coefficient of standard curve equation；c.Recovery=(concentration of sample with added standards-concentration of sample)/concentration of standard added

1.6 数据分析

对不同提取试剂、振荡方法和皂化方法对提取的类胡萝卜素总量进行方差分析，由Excel和SPSS软件进行统计处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同样品制备方法的提取效率比较

(1)不同提取试剂的提取效率：对不同的提取试剂提取的类胡萝卜素总量做邓肯检测(Duncan Test)，结果表明：提取试剂B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)和D乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)提取的类胡萝卜素总量较高，分别为56.37±1.90和53.92±1.90 mg·g-1，两者之间没有显著差异(在P<0.05水平上差异不显著)；其次为提取试剂C乙醇∶丙酮∶正己烷(2∶1∶3/V∶V)和A乙醇∶正己烷(4∶3/V∶V)，提取的类胡萝卜素总量分别为50.91±1.90和48.18±1.90 mg·g-1，两者之间没有显著差异；而提取试剂E丙酮∶乙醇(1∶1/V∶V)的提取效率最低，仅为43.40±1.90 mg·g-1。因此，若只考虑提取试剂这一因素对提取效果的影响，可优先选择丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)或乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)。

(2)不同振荡方法对提取效果的影响：结果显示，温控摇床振荡的方法提取的类胡萝卜素总量为56.43±1.20 mg·g-1，显著高于用超声振荡提取的44.68±1.20 mg·g-1。这种差异产生的原因可能是尽管在超声过程中往水中加入了冰块，但超声振荡能量太高，造成局部温度过高，而类胡萝卜素结构很容易受高温的影响[20]，造成原有类胡萝卜素的解体，从而使样品中的类胡萝卜素含量显著减少。所以在类胡萝卜素样品制备过程中，应尽量避免使用超声振荡的方式进行提取。

(3)不同皂化方法对提取效果的影响：尽管常温皂化和高温皂化都是文献报道中常用的两种方法[15,19]，但是，本试验的研究结果表明，常温皂化更有利于类胡萝卜素的提取。常温下皂化16 h，提取的类胡萝卜素总量为53.73±1.20 mg·g-1，而55℃条件下高温皂化1 h，提取的类胡萝卜素总量为47.38±1.20 mg·g-1，仅为前者的88.18%，这也是由于高温容易使类胡萝卜素降解。

(4)提取试剂和振荡方法交互作用对类胡萝卜素提取效果的影响：在类胡萝卜素提取过程中，提取试剂和振荡方法会对提取效果产生相互影响。表2列出了两个因素交互作用下提取的类胡萝卜素总量均值及其标准差。选取提取试剂B和振荡方法A时，提取的类胡萝卜素总量最高，达到67.318±2.68 mg·g-1，比提取总量第二的组合高出10.161 mg·g-1，而提取的类胡萝卜素总量最低组合为选用提取试剂E和振荡方法B，仅为36.014±2.68 mg·g-1，仅为最佳组合的53.50%。由此可知，在确定最后的样品制备方法时，应选取提取试剂B和振荡方法A组合，以提高类胡萝卜素提取效率。

表2提取试剂和振荡方法共同作用对类胡萝卜素提取效果的影响

Table2Theinfluenceofinteractionbetweenextractionsolventsandshakingmethodsonextractionresult

振荡方法Shakingmethod提取试剂ExtractionsolventsABCDEA53.265±2.6867.318±2.6853.609±2.6857.157±2.6850.682±2.68B43.098±2.6845.414±2.6848.209±2.6850.781±2.6836.014±2.68

(5)不同样品制备方法提取类胡萝卜素总量的多因素方差分析：通过对不同样品制备方法提取的类胡萝卜素总量进行多因素方差分析，得到的结果如表3。试验设置的三个因素：5种提取试剂、两种振荡方法和两种皂化方法对类胡萝卜素总量提取效率均有极显著影响(在P<0.01水平上差异显著)；提取试剂和振荡方法的交互作用对类胡萝卜素总量的提取效率有显著影响(在P<0.05水平上差异显著)。

表3样品制备方法各因素对提取效果的影响

Table3Influenceofvariousfactorsofsamplepreparationonextractionresult

方差来源aSourceofvariance自由度DegreeoffreedomF值Fvalue显著性Significance提取试剂Extractionsolvent47.0680.000**振荡方法Shakingmethod147.7420.000**皂化方法Saponificationmethod114.0040.001**提取试剂×振荡方法Extractionsolvent×Shakingmethod43.1660.024*提取试剂×皂化方法Extractionsolvent×Saponificationmethod42.5060.057振荡方法×皂化方法Shakingmethod×Saponificationmethod12.3680.132提取试剂×振荡方法×皂化方法Extractionsolvent×Shakingmethod×Saponificationmethod40.2350.917

注：a.“×”表示两个或三个因素的共同作用对提取效率的影响；**.P<0.01水平上差异显著；*.P<0.05水平上差异显著

Note: a.“×” represent that the interaction between two or three factors;**.Represent significant differences at the level ofP<0.01;*. Represent significant differences at the level ofP<0.05

从以上分析中可以知道，提取试剂、振荡方法和皂化方法这三个因素只考虑单因素时，分别需要选择提取试剂只考虑提取试剂B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)和D乙酸乙酯∶正己烷(1∶1/V∶V)、温控摇床振荡和室温皂化16 h这三个梯度；但由于提取试剂和振荡方法的交互作用也对类胡萝卜素总量的提取效率有显著影响，所以在选择时需要综合考虑这两个因素交互作用对类胡萝卜素提取效率的影响。虽然这三个因素的交互作用对类胡萝卜素的提取效率没有显著影响，但鉴于类胡萝卜素对高温敏感，还是采取常温皂化的方法为宜。因此本研究最终确定的最佳提取方案为提取试剂B丙酮∶正己烷(3∶5/V∶V)、温控摇床振荡提取，常温皂化16 h。

2.2 类胡萝卜素的鉴定

由于所购得的标准品种类有限，没有标准品作为对照的类胡萝卜素我们通过几种途径进行鉴定。首先依据的是其质谱信息；但由于类胡萝卜素存在诸多顺反异构体，无法完全通过质谱信息进行结构鉴定，需要通过紫外光谱特征进行鉴定。紫外光谱主要有2个参数作为定性依据：最大吸收波长(λmax)和Q-ratio[15,21～22]。大多数类胡萝卜素结构中存在顺式(cis)键时，最大吸收波长有蓝移效应(hypsochromic shift)，即最大吸收波长相对于全反式结构(all-trans)要小； Q-ratio是光谱吸收峰中，顺式峰(cis-peak)的高度与最大吸收峰峰高的比值(图1)，是类胡萝卜素顺反异构体鉴定的重要依据。通过比较试验得到的λmax、Q-ratio和参考文献中报道的这三个值，可以基本确定不同种类类胡萝卜素的顺反异构体(表4)。

图1 全反式番茄红素(--)和15-顺式番茄红素()的紫外吸收光谱图[4]Fig.1 Photodiode array spectra of all-trans-lycopene(--) and 15-cis-lycopene()

Table4IdentificationofcarotenoidsandthecompositionandcontentofcarotenoidsintwodifferentcolorsofHemerocallispetals

保留时间Retentiontime物质名称Compoundsname最大吸收波长λmaxQ-ratio质谱信息MSdata含量干重Content(mg·g-1DW)大苞萱草H.middendorfiiTrautv.etMey.‘原谅’萱草H.‘PardonMe’参考文献References2.57all-trans-β-Carotene436、462、488—536[M]+34.2442.372.78β-caroteneisomer328、434、4580.50536[M]+6.016.0021、233.35β-caroteneisomer371、437、463—536[M]+、467[M-69]+12.037.263.50aluteinisomer262、427、4560.24569[M+H]+、551[M+H-18]+16.031.1618、163.635,6-epoxy-β-Carotene437、462、4850.14553[M+H]+、535[M+H-18]+、461[M+H-92]+—7.17243.73aluteinisomer262、456、4890.21569[M+H]+、551[M+H-18]+—2.573.91bα-cryptoxanthin434、463、489—552[M]+、460[M-92]+3.833.9325、244.039or9'-cis-lutein371、437、4630.15569[M+H]+、551[M+H-18]+2.374.3426、21、234.29β-cryptoxanthin437、463—553[M+H]+、461[M+H-92]+6.866.22224.41aDihydrolutein264、433、4580.17570[M]+、552[M-18]+0.861.104.5cis-β-cryptoxanthin266、437、4630.14553[M+H]+、461[M+H-92]+4.814.244.56luteinisomer270、437、4630.15569[M+H]+2.912.5618、164.84luteinisomer263、433、4580.18569[M+H]+2.041.735.07aviolaxanthin428、4570.21624[M+Na]+、601[M]+、583[M-18]+—5.86235.23lutein438,463—592[M+Na]+、569[M+H]+、551[M+H-18]+2.671.105.28antheraxanthin263、433、4590.13585[M+H]+、493[M+H-92]+4.277.46155.37bzeaxanthinisomer266、437、4630.15569[M+H]+4.83—5.40aall-trans-neoxanthin413、438、462—624[M+Na]+、601[M]+、583[M-18]+—3.78155.52zeaxanthin438、4640.15568[M]+、477[M+H-92]+18.376.535.89bzeaxanthinisomer328、434、4580.38569[M+H]+、551[M+H-18]+、477[M+H-92]+4.25—总量Total126.38115.36

图2 UPCC方法优化前后效果对比图 A.梯度优化前；B.流动相优化前；C.流动相和梯度优化后Fig.2 Optimization of UPCC analysis A.Before gradient optimization; B.Before mobile phase optimization; C.After gradient and mobile phase optimization

2.3 类胡萝卜素UPCC-MS检测方法优化

UPCC方法的流动相B相固定为超临界CO2，A相可变，因此，在探究UPCC分析方法时，改变流动相A相的种类来探究较优方法。通过比较甲醇和乙醇的洗脱效果(图2)，最终选定流动相A相为乙醇。为探究流动相梯度是否对洗脱效果有影响，选定流动相A相后又改变了原定的流动相梯度，前后效果如图(图2)。结果表明，流动相梯度的变化对洗脱效果有很明显的影响。最终选定梯度如1.4所述。质谱参数通过标准品调谐获得。

2.4 两种不同颜色萱草花瓣中的类胡萝卜素种类及含量

大苞萱草(颜色为RHSCC Yellow Orange 23A)和‘原谅’萱草(RHSCC颜色为Red 47A)花瓣中类胡萝卜素种类和含量如表4所示。大苞萱草花瓣中含有16种类胡萝卜素物质，总含量为126.38 mg·g-1(DW)，其中含量最高的是all-trans-β-carotene，含量为34.24 mg·g-1(DW)，含量最低的为dihydrolutein，含量为0.86 mg·g-1(DW)。‘原谅’萱草花瓣中含有18种类胡萝卜素，总含量为115.36 mg·g-1(DW)，含量最高的也是all-trans-β-carotene，为42.37 mg·g-1(DW)，dihydrolutein和lutein的含量均最低，为1.10 mg·g-1(DW)。比较两种不同颜色的萱草花瓣中类胡萝卜素的组成和含量可知，两种花瓣中所含类胡萝卜素种类有所差别，差异最大的是‘原谅’萱草花瓣中含有violaxanthin、all-trans-neoxanthin和5,6-epoxy-β-Carotene这三种物质而大苞萱草花瓣中没有；大苞萱草花瓣中含有cis zeaxanthin但‘原谅’萱草花瓣中不含有。两者的类胡萝卜素总量相差不大。

3 讨论

UPCC作为一种新型的色谱分离技术，对分析像类胡萝卜素这样极性小的物质具有极大的便捷之处。在本研究中，只需10 min便可分析一个样品，极大提高了分离的效率，也减少了化学试剂的消耗；设置的梯度洗脱程序对样品中的类胡萝卜素有很高的分离度，共分离出20种类胡萝卜素物质；UPCC技术采用超临界CO2作为流动相之一，另一流动相为乙醇，减少了有毒化学试剂的使用，更符合绿色化学的理念。因此，本研究开发的UPCC-MS检测类胡萝卜素的方法具有很强的使用价值和广阔的应用性。

萱草作为一种重要的观赏植物，构成其花瓣色彩丰富的化学物质基础和花色形成机制尚未完全研究清楚。开展萱草花瓣中类胡萝卜素的研究，结合本研究组之前已对萱草花瓣中类黄酮化合物(包括花青素)的研究，更有利于系统地揭示萱草花色的成因。而且，黄花菜作为中国的传统蔬菜，早在2000多年前就被人食用，基于类胡萝卜素多样的保健作用，可以推测，我国古代劳动人民将黄花菜作为蔬菜食用或许正是因为其中含有丰富的类胡萝卜素物质。因此，本试验开发的萱草花瓣中类胡萝卜素的样品制备方法和检测方法对萱草属和其他属植物一些食用品种食用品质的评价具有很好的借鉴作用和实际的应用价值。

1.李秀华,杜贞,武银玉,等.大花萱草组培快繁体系的研究[J].植物研究,2009,29(6):757-762.

Li X H,Du Z,Wu Y Y,et al.Research on tissue culture regeneration ofHemerocallismiddendorfii[J].Bulletin of Botanical Research,2009,29(6):757-762.

2.焦芳.萱草属植物花香挥发性成分及类黄酮色素分析[D].北京:中国科学院大学,2016.

Jiao F.Analysis of the volatile components of floral fragrances and flavonoids in the genusHemerocallis[D].Beijing:University of Chinese Academy of Sciences,2016.

3.Griesbach R J,Batdorf L.Flower pigments withinHemerocallisfulvaL.fm.fulva,fm.rosea,and fm.disticha[J].Hortscience April,1995,30(2):353-354.

4.Rodriguez-amaya D B.A guide to carotenoid analysis in foods[M].Washington,D.C.:International Life Sciences Institute,2001.

5.戴雄泽,王利群,陈文超,等.辣椒果实发育过程中果色与类胡萝卜素的变化[J].中国农业科学,2009,42(11):4004-4011.

Dai X Z,Wang L Q,Chen W C,et al.Changes of fruit colors and carotenoid contents during the development of pepper fruit[J].Scientia Agricultura Sinica,2009,42(11):4004-4011.

6.李福枝,刘飞,曾晓希,等.天然类胡萝卜素的研究进展[J].食品工业科技,2007,28(9):227-232.

Li F Z,Liu F,Zeng X X,et al.The research progress of natural carotenoid[J].Science and Technology of Food Industry,2007,28(9):227-232.

7.Semba R D,Lauretani F,Ferrucci L.Carotenoids as protection against sarcopenia in older adults[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2007,458(2):141-145.

8.Rao A V,Rao L G.Carotenoids and human health[J].Pharmacological Research,2007,55(3):207-216.

9.Tanaka T,Shnimizu M,Moriwaki S.Cancer chemoprevention by carotenoids[J].Molecules,2012,17(3):3202-3242.

10.Bolhassani A,Khavari A,Bathaie S Z.Saffron and natural carotenoids:biochemical activities and anti-tumor effects[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Reviews on Cancer,2014,1845(1):20-30.

11.Srinivasan M,Kalpana K B,Devipriya N,et al.Protective effect of lycopene on whole body irradiation induced liver damage of Swiss albino mice:pathological evaluation[J].Biomedicine & Preventive Nutrition,2014,4(2):87-94.

12.Gammone M A,Pluchinotta F R,Bergante S,et al.Prevention of cardiovascular diseases with carotenoids[J].Frontiers in Bioscience,2017,9(1):165-171.

13.严娟,蔡志翔,沈志军,等.黄肉桃果实中类胡萝卜素提取和测定方法研究[J].果树学报,2015,32(6):1267-1274.

Yan J,Cai Z X,Shen Z J,et al.Extraction and analytical methods of carotenoids in fruit of yellow flesh peach[J].Journal of Fruit Science,2015,32(6):1267-1274.

14.Kurz C,Carle R,Schieber A.HPLC-DAD-MSn characterisation of carotenoids from apricots and pumpkins for the evaluation of fruit product authenticity[J].Food Chemistry,2008,110(2):522-530.

15.Delpino-rius A,Eras J,Marsol-vall A,et al.Ultra performance liquid chromatography analysis to study the changes in the carotenoid profile of commercial monovarietal fruit juices[J].Journal of Chromatography A,2014,1331:90-99.

16.Li H Y,Deng Z Y,Liu R H,et al.Ultra-performance liquid chromatographic separation of geometric isomers of carotenoids and antioxidant activities of 20 tomato cultivars and breeding lines[J].Food Chemistry,2012,132(1):508-517.

17.陈敏氡,朱海生,温庆放,等.UPLC测定草莓果实中类胡萝卜素含量[J].果树学报,2013,30(4):706-711.

Chen M D,Zhu H S,Wen Q F,et al.Determination of carotenoids in strawberry by UPLC[J].Journal of Fruit Science,2013,30(4):706-711.

18.Lin C H,Chen B H.Determination of carotenoids in tomato juice by liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,2003,1012(1):103-109.

19.Liu S C,Lin J T,Yang D J.Determination of cis- and trans- α- and β-carotenoids in Taiwanese sweet potatoes(Ipomoeabatatas(L.) Lam.) harvested at various times[J].Food Chemistry,2009,116(3):605-610.

20.De Quirós A R B,COSTA H S.Analysis of carotenoids in vegetable and plasma samples:A review[J].Journal of Food Composition and Analysis,2006,19(2-3):97-111.

21.Chen J P,Tai C Y,Chen B H.Improved liquid chromatographic method for determination of carotenoids in Taiwanese mango(MangiferaindicaL.)[J].Journal of Chromatography A,2004,1054(1-2):261-268.

22.Lacker T,Strohschein S,Albert K.Separation and identification of various carotenoids by C30reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to UV and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric detection[J].Journal of Chromatography A,1999,854(1-2):37-44.

23.Inbaraj B S,Chien J T,Chen B H.Improved high performance liquid chromatographic method for determination of carotenoids in the microalgaChlorellapyrenoidosa[J].Journal of Chromatography A,2006,1102(1-2):193-199.

24.Rivera S M,Christou P,Canela-garayoa R.Identification of carotenoids using mass spectrometry[J].Mass Spectrometry Reviews,2014,33(5):353-372.

25.Rivera S,Vilaró F,Canela R.Determination of carotenoids by liquid chromatography/mass spectrometry:effect of several dopants[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011,400(5):1339-1346.

26.Liu H L,Kao T H,Chen B H.Determination of carotenoids in the Chinese medical herb Jiao-Gu-Lan(GynostemmapentaphyllumMAKINO) by liquid chromatography[J].Chromatographia,2004,60(7-8):411-417.

Beijing municipal science and technology commission project(D161100001916001)

introduction：ZHAO Xin-Xin(1992—),female,master,specializing in cultivation and application of garden plants.

date:2017-02-16

SamplePreparationandUPCC-MSDeterminationMethodofCarotenoidsinPetalsofHemerocallis

ZHAO Xin-Xin1,2JIAO Fang2,3SUN Guo-Feng2ZHANG Jin-Zheng1,2*

(1.College of Landscape Architecture and Arts,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100； 2.Key Laboratory of Plant Resources,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100093； 3.Beijing Florascape Company,Beijing 100044)

The petals ofHemerocallismiddendorfiiTrautv. et Mey. andH. ‘Pardon Me’ were used to study the sample preparation method of carotenoids, and the samples were qualitatively and quantitatively analyzed by UPCC-MS. Results showed that: (1)In the process of carotenoids sample preparation, different extraction solvents, shaking methods and saponification methods have significant influence on the extraction efficiency of carotenoids, and by multi-factor analysis of variance, the optimal extraction method was determined as follows: B acetone:hexane(3:5/V:V) as extraction solvents, extracted in a shaking incubator and saponification 16 h at room temperature; (2)UPCC-MS technology can separate the carotenoids in samples efficiently in 10 min, and with lesser use of toxic chemicals, UPCC-MS can considered to be a good choice for analyzing carotenoids; (3)There are 20 kinds of carotenoids inH.middendorfiiandH. ‘Pardon Me’ petals, and these two kinds of materials with different colors had different composition and content of carotenoids.

Hemerocallis;carotenoids;sample preparation;UPCC-MS

北京市科学技术委员会项目(D161100001916001)

赵薪鑫(1992—)，女，硕士研究生，主要从事园林植物培育与应用方面的研究。

* 通信作者：E-mail：caohua@ibcas.ac.cn

2017-02-16

* Corresponding author：E-mail：caohua@ibcas.ac.cn

Q949.71+8.23

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.016