多菌株联合发酵玉米秸秆的固态发酵条件优化

张 昕， 金和花， 王雪莹， 田家英

多菌株联合发酵玉米秸秆的固态发酵条件优化

张 昕， 金和花， 王雪莹*， 田家英

（吉林工商学院粮食学院，吉林长春 130507）

为研究平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉多菌株联合发酵玉米秸秆的固态发酵条件，本试验对玉米秸秆固态发酵过程中原料的初始pH、含水量、发酵温度、发酵时间进行了优化。结果表明：玉米秸秆固态发酵工艺条件为原料初始pH为5.5，原料含水量为65%，发酵温度为25℃，发酵时间为120 h。在最优发酵条件下联合发酵菌株滤纸酶活力（FPA）为 13.57 IU/g。

玉米秸秆；发酵；纤维素酶

This paper studied on the optimization of solid-state fermentation conditions of corn-stalks through multistrains’co-fermenting process，which included the Pleurotusostreatus PL-01，Aspergillusniger M6.300 and Trichodermareesei.The solid-state fermentation conditions of initial pH，moisture content of raw material，fermentation temperature，fermentation time were optimized.The results showed that the conditions of solid-state fermentation were initial pH 5.5，moisture content 65% ，fermentation temperature 25 ℃ ，fermentation time 120 h.The FPA enzyme activity of co-fermented strains reached 13.57 IU/g under these conditions.

corn stalk；fermentation conditions；cellulase

我国玉米秸秆年产量约2.6亿吨，有效利用率50%左右（杨轶囡等，2016）。由于秸秆资源化利用的技术还不够成熟，仍然有大部分的秸秆被焚烧，造成资源的巨大浪费和环境污染。玉米秸秆的基本成分中，纤维素约占干重的37.3%，半纤维素20.6%，木质素17.5%（张强等，2007）。目前玉米秸秆资源化利用的瓶颈问题，就是秋季玉米秸秆收割后，秸秆运输成本高、贮藏困难，秸秆中纤维素降解周期长，秸秆资源化利用的相关技术难以转化为工业化生产。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，其不是单组分酶，多达十几种组分。主要包括 3大类：内切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucanglu canohydrolase，EC 3.2.1.4， 也称 CMC 酶，EG），这类酶可作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。外切葡聚糖 酶 （1，4-β -D-glucan cellobiohydrolase， EC 3.2.1.91，也称纤维二糖水解酶，CBH），这类酶可作用于纤维素线性分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。β-葡萄糖苷酶（1，4-β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21， 也称纤维二糖酶，BG或CB），这类酶将纤维二糖水解为葡萄糖。当以上三种酶主要成分的活性比例适当时，则能协同作用完成对纤维素的降解（张昕等，2011）。

本研究利用玉米秸秆为原料，选择平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉作菌种，采用田间窖贮多菌株联合固态发酵方式，生产玉米秸秆发酵饲料。优化玉米秸秆固态发酵原料的初始pH、含水量、发酵温度、发酵时间（何国庆等，2009），为生产玉米秸秆发酵饲料提供工艺参数。在三株真菌酶系的协同作用下，实现对玉米秸秆中纤维素的降解和益生菌的大量繁殖，利用无机氮源产生新的氨基酸、菌体蛋白、生长因子、免疫物质（曾莹等，2004）。有效提高玉米秸秆的饲用价值。

1 材料与方法

1.1 原料 玉米秸秆、苜蓿，产自吉林省长春市九台区，玉米成熟后秸秆上部有5片绿叶时的秸秆；水解羽毛粉，石家庄宏辉生物科技有限公司羽毛粉；其他试剂，上海国药集团化学试剂分析纯。

平菇（Pleurotus ostreatus）PL-01、黑曲霉（Aspergillus niger）M6.300、里氏木霉（Trichoderma reesei）为吉林工商学院微生物实验室保存菌种。

1.2 玉米秸秆固态发酵原料配方 玉米秸秆粒（直径 2.80 mm）100.00 g，尿素 0.80 g，硫酸铵 1.80 g， 硫酸镁 0.02 g，磷酸氢二钾 0.06 g（张昕等，2016）。

1.3 酶活力测定

1.3.1 粗酶液提取 取玉米秸秆固态发酵料5.00 g于研钵中，加入0.05 mol/L的pH 4.8柠檬酸缓冲液50 mL研碎，取上清液过滤，6000 r/min、4℃离心15 min，取上清液即为粗酶液（李冠杰等，2015）。

1.3.2 滤纸酶活（FPA）的测定 在25 mL具塞试管中加pH 4.8柠檬酸缓冲液1 mL，再加入一条WhatmanNo.1滤纸（60mm×10mm），50℃预热 8 min后加入0.5 mL粗酶液，50℃保温30min，加入3 mL的DNS液，在沸水浴5 min，用流动冷水终止反应，加蒸馏水至25 mL，混合均匀（王菁莎等，2006）。滤纸沉淀后，取上清液在540 nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准曲线计算生成的还原糖量。同时用失活的粗酶液作对照（韩立荣等，2008）。

一个滤纸酶活力国际单位（FPIU）定义为在酶促反应中每分钟生成1.0 μmol葡萄糖所需的酶量。滤纸酶活力（FPA）以 IU/g表示（刘韫滔等，2008）。

图1 玉米秸秆固态发酵原料的初始pH优化试验结果

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆固态发酵原料的初始pH优化试验结果 把玉米秸秆固态发酵原料的初始pH分别 调 到 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。 采 用 平 菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉联合发酵玉米秸秆，接种量（g/g）分别为 3%、2%、5%，原料的含水量为 70%，29 ℃发酵 96 h（罗洋等，2014），发酵结束后提取粗酶液分别测定FPA酶活力，优化玉米秸秆固态发酵原料的初始pH结果见图1。

由图1可知，玉米秸秆固态发酵原料的初始pH为3.5～5.0时，酶活力逐渐增大，pH为5.0时酶活力达到高峰，pH大于5.0时，酶活力明显下降。表明发酵原料的初始pH不仅影响联合发酵菌株的生长及细胞代谢能力，而且影响各菌株产纤维素酶活力，通过优化得到联合发酵菌株FPA酶活力较高的原料初始pH分别为4.5、5.0、5.5。

2.2 玉米秸秆固态发酵原料的含水量优化试验结果 把玉米秸秆固态发酵原料的含水量分别调到 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%，原料的初始pH为5.0，采用平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉联合发酵玉米秸秆，接种量（g/g）分别为3%、2%、5%，29℃发酵96 h，发酵结束后提取粗酶液分别测定FPA酶活力，优化玉米秸秆固态发酵原料的含水量结果见图2。

图2 玉米秸秆固态发酵原料的含水量优化试验结果

由图2可知，玉米秸秆固态发酵原料含水量为45%～65%时，随着原料含水量的增加，酶活力明显提高，原料的含水量超过65%以后，随着含水量的升高酶活力缓慢下降。真菌的生长需要大量的自由水，含水量低于55%不利于真菌的生长；在试验过程中发现，含水量大的培养基经过灭菌后黏稠结块，导致培养基中含氧量降低，真菌的生长繁殖和产酶需要大量的氧，培养料加水量过大使真菌因缺氧而生长繁殖和产酶受到抑制。通过优化得到联合发酵菌株FPA酶活力较高的原料含水量分别为60%、65%、70%。

2.3 玉米秸秆固态发酵温度的优化试验结果 玉米秸秆固态发酵原料的含水量为65%，原料的初始pH为5.0，平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉联合发酵玉米秸秆，接种量（g/g）分别为3%、2%、5%，把培养温度分别设定为 23、25、27、29、31、33、35 ℃发酵 96h，发酵结束后提取粗酶液分别测定FPA酶活力，优化玉米秸秆固态发酵温度结果见图3。

图3 玉米秸秆固态发酵温度的优化试验结果

由图3可知，培养温度为23～27℃时，随着温度的升高，酶活力明显提高；温度为27～31℃时，随着温度的升高，酶活力缓慢下降；超过 31℃以后，随着温度的升高酶活力明显下降。由于玉米秸秆固态发酵采用平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉三株真菌联合发酵，每株真菌生长及产酶的最适宜温度不同，因此通过优化试验选择联合发酵菌株的最适宜发酵温度尤为重要，发酵温度明显影响微生物的生长及产酶。试验中发现发酵温度33℃以上细菌污染的几率也会提高。通过优化得到联合发酵菌株FPA酶活力较高的发酵温度分别为 25、27、29 ℃。

2.4 玉米秸秆固态发酵时间的优化试验结果玉米秸秆固态发酵原料的含水量为65%，原料的初始pH为5.0，平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉联合发酵玉米秸秆，接种量（g/g）分别为3%、2%、5%，培养温度 27 ℃，分别培养 60、72、84、96、108、120、132 h后测定菌体FPA酶活力，优化玉米秸秆固态发酵时间结果见图4。

图4 玉米秸秆固态发酵时间的优化试验结果

由图4可知，发酵时间为60～72 h时，酶活力上升缓慢；可能由于微生物生长处于适应期，需要合成大量的诱导酶，细胞数未达到高峰，因此产生的纤维素酶较少；发酵时间为72～120 h时，酶活力上升较快；可能由于微生物生长处于对数期和稳定期，已经合成大量的诱导酶，细胞数达到高峰，因此产生大量的高活力纤维素酶；120 h以后酶活力出现下降，可能是由于发酵液的pH变化及孢子的形成引起的。综和分析酶活力和经济效益，优化得到联合发酵菌株FPA酶活力较高的发酵时间分别为 108、120、132 h。

2.5 优化玉米秸秆固态发酵条件L9（34）正交试验结果 选择单因素优化的玉米秸秆固态发酵原料的初始pH、含水量、发酵温度、发酵时间四因素的三水平，以联合发酵菌株FPA酶活力为指标。设计L9（34）正交试验，优化玉米秸秆固态发酵的最优工艺条件结果见表1。

表1 优化玉米秸秆固态发酵条件L9（34）正交试验结果

由表1可知，各因素对联合发酵菌株FPA酶活力的影响大小顺序依次为D＞C＞B＞A，即发酵时间＞发酵温度＞原料含水量＞原料的初始pH。最佳方案为A3B2C1D2，即玉米秸秆固态发酵原料的初始pH为5.5，原料的含水量为65%，发酵温度25℃，发酵时间120 h。

2.6 试验验证 为了验证L9（34）正交试验方法优化多菌株联合发酵玉米秸秆的固态发酵条件的可行性，运用正交试验优化固态发酵工艺条件得到的工艺参数，以联合发酵菌株FPA酶活力为指标，试验做3个平行。测得的联合发酵菌株FPA酶活力为13.57 IU/g，说明采用L9（34）正交试验方法优化多菌株联合发酵玉米秸秆的固态发酵条件合理可行。

3 结论

通过单因素试验对玉米秸秆固态发酵条件的优化，确定联合发酵菌株FPA酶活力较高的玉米秸秆固态发酵条件为原料初始pH为5.0，原料的含水量为65%，发酵温度27℃，发酵时间120 h。

通过L9（34）正交试验对玉米秸秆固态发酵条件的优化，确定联合发酵菌株FPA酶活力较高的玉米秸秆固态发酵条件为原料的初始pH为5.5，原料的含水量为65%，发酵温度25℃，发酵时间120 h。

在优化的发酵条件下进行验证试验，测得联合发酵菌株FPA酶活力为13.57 IU/g。说明采用L9（34）正交试验方法优化多菌株联合发酵玉米秸秆的固态发酵条件合理可行。

本研究采用正交试验设计方法，与响应面优化方法相比具有一定的局限性。下一步拟采用响应面优化法对玉米秸秆固态发酵工艺进行优化，以得到更高FPA酶活力，为工业化生产提供工艺参数。

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S816.6

A

1004-3314（2017）22-0015-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172204

吉林省大学生创新创业项目

*通讯作者