几个关键油脂合成酶活性对油菜含油量影响的研究

刘祥含 唐天向 孙 超 隋丽波 张 慧 张传利 李丽萍 林良斌

(云南农业大学农学与生物技术学院1，昆明 650201) (云南农业大学热带作物学院2, 普洱 665000) (云南农业大学农科专业实验教学中心3，昆明 650201)

几个关键油脂合成酶活性对油菜含油量影响的研究

刘祥含1唐天向1孙 超1隋丽波1张 慧1张传利2李丽萍3林良斌1

(云南农业大学农学与生物技术学院1，昆明 650201) (云南农业大学热带作物学院2, 普洱 665000) (云南农业大学农科专业实验教学中心3，昆明 650201)

以不同含油量的甘蓝型油菜品种或品系为材料，采用ELISA 法检测了油脂累积过程中乙酰辅酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷脂酸磷酸酯酶、二酰甘油酰基转移酶等4种关键酶在不同发育时期的种子和角果皮中的酶活性变化，并分析了酶活性与种子含油量的相关性。研究结果表明，不同含油量的油菜品种在种子和角果皮中酶活性的变化趋势基本一致，在开花后第17天至第24天迅速增加，第38天时达到峰值，然后逐渐下降，但角果成熟时间较短的酶活性下降很快，如花油8号的角果成熟期只有40.2 d，比其他3个品种早熟1周。相关性分析表明种子中DGAT、PPase、G6PDH的酶活性与菜籽含油量呈极显著正相关，ACCase酶活性与菜籽含油量呈显著正相关，而角果皮中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT的酶活性与菜籽含油量呈正相关，但没达到显著水平，其中4种酶的酶活性与菜籽含油量的相关性大小依次为DGAT、PPase、G6PDH、ACCase。因此，在进行高含油量油菜品种选育时应着重考虑油脂累积中DGAT、PPase的基因表达水平和酶活性水平。

油菜 含油量 ACCase G6PDH PPase DGAT

油菜(Brassicanapus)是我国乃至世界上的主要油料作物之一，是植物油脂的第三大来源，我国的油菜种植面积和总产量均位居世界第一[1]，菜籽的含油量直接影响着油菜的经济效益，是当前油菜育种中重要的技术难点，因此提高菜籽含油量是当前油菜育种的主要目标之一[2]。油菜种子油脂累积涉及十多个酶促反应，酶活性的高低直接影响着菜籽的含油量。近年来国内外研究者对酶活性与含油量的关系开展了一些研究工作，例如，Turnham 等[3]研究表明油菜种子中脂肪酸合成速率受控于ACCase活性的高低，认为ACCase是油菜种子中油脂累积的一个关键限速酶；Ohlrogge等[4-5]和Topfer等[6]的研究认为对油菜种子油脂累积关键受ACCase、PPase和DGAT等酶活性高低的影响；陈玉萍等[7]研究结果表明高含油量油菜品系的G6PDH活性高于低含油量品系，且油分合成旺盛的时期G6PDH活性最大；唐湘如等[8]研究表明，油菜种子的PPase酶活性与种子含油量有密切关系，在育种中可作为选择高含油量品种的生化指标之一。然而前人研究一般以2个不同含油量的油菜品种为材料，只对油脂累积过程中1～3个酶进行研究，并且没有进行不同发育时期的酶活性变化规律研究和生物统计学相关性分析。

本研究以不同含油量4个油菜品种或系为材料，研究了油菜种子发育过程中乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoAcarboxylase ，ACCase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH)、磷脂酸磷酸酯酶(Phospha-tidic acid phophyhydrolase，PPase)、二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycero-lacyl transferase，DGAT)4种酶在油菜种子发育过程中种子和角果皮中的酶活性变化趋势及酶活性高低与含油量的关系，并进行了种子酶活性高低与菜籽含油量的相关性分析，同时研究了4个油菜品种的生育习性，希望弄清相关酶活性及生育习性对菜籽含油量的影响及其程度大小，从而揭示油菜高含油量的生理生化机制，希望在酶促反应相关酶活性及变化趋势上为育成高含油量油菜提供了酶活力数据的支持，从而为油菜高含油量育种和栽培提供酶活性及生育习性方面的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为4个不同含油量的甘蓝型油菜品种或品系，即是：ZY511，其种子含油量为 50.21%；LCD07-4，其种子含油量为47.19%；花油8号，其种子含油量为42.57%；湘油774，其种子含油量为37.32%，均由云南农业大学油菜研究室提供。

ELISA试剂盒：上海优选生物科技有限公司，型号分别为CK-E0066P、CK-E0089P、CK-E0173P和CK-E0256P。

1.2 试验方法

1.2.1 油菜种植与取样

4个油菜材料于2015年10月10日种植于云南农业大学后山农场，并进行常规油菜栽培管理。在油菜开花时对植株长势一致的主花序基部1/3处当天开放的花蕾进行挂牌，并标记日期。在开花后第17天进行取样，每隔7 d取样1次，共5次，每个品种取样3株。将取下的样品立即放入冰盒中，在冰浴中迅速将种子和角果分离，分别称重0.2 g鲜组织用液氮迅速冷冻后保存于-80 ℃冰箱保存备用，每种组织材料保存4份，用于粗酶液的提取。

1.2.2 油菜生育习性调查

每个材料随机取5株分别记录每株花期(以第1朵花开到最后1朵花落)、角果成熟期(以主花序中部角果从花落到角果成熟)、生育期(从播种到成熟收获)。

1.2.3 粗酶液的分离制备

从-80 ℃冰箱中取出材料放入研钵中加液氮研磨成粉末，并迅速尽量全部转移入10 mL离心管内，加入2 mL预冷的提取Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH=7.3、300 mmol/L 甘油、5 mmol/L DTT、2 mol/L EDTA、0.5 mmol/L PMSF、0.01%体积Triton X-100)，然后在涡旋振动器上振动2 min充分混匀后4 ℃静置1 h，再加10 μL 0.5 mmol/L PMSF并混匀，4 ℃静置1 h。4 ℃、3 500 r/min离心30 min，将上清液尽量转移到另一离心管内，并定容至体积2 mL，即为粗酶液，用于酶活性测定。

1.2.4 ELISA法测定酶活性

在酶标板上设置标准品孔、样本孔和空白孔，用于标准曲线制作、样本酶活性检测和酶标仪零校对。标准品孔各加不同酶活力单位的标准品50 μL；样本孔加待测样本10 μL(以a表示)，再加样本稀释液40 μL；空白孔加去离子10 μL，再加样本稀释液40 μL。吸附结合30 min钟后用洗涤液洗板5次。然后每孔加入辣根过氧化物酶标记抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴保温60 min，弃去液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加洗涤液300 μL，静置1 min，弃去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。每孔再加入底物 A、底物B各50 μL，37 ℃ 水浴避光保温15 min。然后每孔再加入终止液50 μL，15 min 内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。然后以标准孔的OD450值和相应标准品的酶活力单位制作标准曲线。然后以样品孔的OD450值根据标准曲线获得粗酶液样品的酶活力单位(以b表示)。每克鲜组织的酶活力按公式计算(1 U是指在标准条件下1 min能转化1 μmol底物的所需酶量)，各样品的酶活性测定重复3次。

U/g=b/a×2 000÷0.2

1.2.5 数据处理方法

采用Excel 2010作图；采用SPSS统计分析软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同含油量油菜品种的生育习性

随机选取5株，对各油菜品种的生育习性进行调查，结果表明(表1)，试验材料的生育期不同，花油8号为早熟品种，生育期只有176.6 d，而其他3个材料生育期相差不大，较花油8号晚熟10 d以上。生育期长的材料，其角果成熟期和花期也相对较长，但角果成熟期变化较大，花油8号比其他3个材料短1周以上，而花期变化较小，花油8号比其他3个材料短2 d。

表1 不同油菜品种的生育习性

2.2 种子和角果皮中ACCase的活性变化及其对菜籽含油量的影响

对不同含油量的油菜品种/品系进行了种子和角果皮的ACCase活性检测，结果(图1)表明，所有研究对象的种子ACCase活性均高于角果皮的，特别是在中期角果中高2U左右。在开花后17～38 d各试验材料种子和角果皮的ACCase活性呈上升变化，其中从开花后17～24 d ACCase活性上升很快，但种子的比角果皮的上升要缓慢些，而在24 d后种子的比角果皮的上升要快些。第38天后除花油8号的迅速下降，湘油774的稍有上升，其他2个材料的不再呈上升趋势，这可能与花油8号的角果成熟期短有关，因为38 d时它的角果开始变黄成熟，而其他品种在45 d后才开始变黄成熟。在不同发育时期的种子中含油量高的材料的ACCase活性均高于含油量低的，只是幅度不一样，但角果皮的ACCase活性就不呈现这样一个关系，如在中期角果中LCD07-4角果皮的ACCase活性接近甚至略高于ZY511的。这可能是由于角果皮主要是在进行光合作用和物质积累，为油脂合成和累积提供物质和能量，因此，角果皮中油脂合成酶的活性可能与菜籽含油量高低关系不大。

图1 种子和角果皮中ACCase活性动态变化

2.3 种子和角果皮中G6PDH活性变化及其对菜籽含油量的影响

对不同含油量的油菜品种/品系进行了种子和角果皮的G6PDH活性检测，结果(图2)表明，所有材料的种子G6PDH活性均高于角果皮的，不同时期的种子和角果皮的酶活性变化趋势如同ACCase，但从开花后17～24 d 酶活性上升非常缓慢，从24～31 d酶活性迅速上升，31～38 d G6PDH活性上升速度变缓，从38～45 d花油8号迅速下降，而其他3个材料的种子中酶活性或保持不变或略有下降，其原因如上所述。在第31天后含油量高的材料的种子和角果皮中的G6PDH活性均高于含油量低的，但31 d前并不呈现这样的关系，花油8号的酶活性还高于LCD07-4，说明这个酶在31 d后对油脂累积影响比较大。

图2 种子和角果皮中G6PDH活性动态变化

2.4 种子和角果皮中PPase活性变化及其对菜籽含油量的影响

对不同含油量的油菜品种/品系进行了种子和角果皮的PPase活性检测，结果(图3)表明，所有试验材料的种子PPase活性均高于角果皮的，不同时期的种子和角果皮的酶活性变化趋势如同前2种酶的活性变化。除LCD07-4外，其他3个材料在第38天前种子中的PPase活性均呈持续上升，而LCD07-4在24～31 d PPase活性上升非常缓慢，以致早期角果酶活性高的LCD07-4在中期角果中与花油8号的酶活性处于相同的水平，但第38天后花油8号的PPase活性迅速下降，这可能是花油8号的含油量低于LCD07-4的原因。在角果皮中第31天前的PPase活性均呈较迅速上升，第31天后除了湘油774的酶活性呈持续上升外，花油8号开始下降，并在38 d后迅速下降，其他2个材料酶活性上升缓慢或略有下降。在不同发育时期的种子和角果皮中含油量高的材料PPase活性一般都高于含油量低的，但LCD07-4与花油8号不呈现这种关系，可能与花油8号油脂累积时间短、第38天后其PPase活性迅速下降有关。

图3 种子和角果皮中PPase活性动态变化

2.5 种子和角果皮中DGAT活性变化及其对菜籽含油量的影响

对不同含油量的油菜品种/品系进行了种子和角果皮的DGAT活性检测，结果(图4)表明，所有研究对象的种子DGAT活性均高于角果皮的，在38 d前种子中DGAT活性除湘油774呈缓慢上升外，其他3个材料呈迅速上升，38 d后除花油8号的迅速下降外，其他3个材料的呈非常缓慢上升或保持不变。在角果皮中DGAT活性各试验材料38 d前均呈缓慢上升，38 d后除花油8号的迅速下降外，其他3个材料保持不变或稍有下降。在不同发育时期的种子中含油量高的材料DGAT活性均高于含油量低的，但角果皮就不呈现这种关系，如含油量低的花油8号还高于含油量高的LCD07-4，这说明种子中DGAT活性对菜籽含油量的影响更大。

图4 种子和角果皮中DGAT活性动态变化

2.6 油脂累积的关键酶分析

分别对种子和角果皮中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT酶活性与菜籽含油量进行相关性分析，结果(表2)表明，在种子中4种酶的活性与菜籽含油量呈显著正相关，而角果皮中4种酶的活性与菜籽含油量呈正相关，但没达到显著水平，说明种子中酶活性对菜籽含油量的影响显著大于角果皮的，而且种子中、DGAT的酶活性与菜籽含油量呈极显著正相关，其相关性大小依次为DGAT>PPase>G6PDH>PPase，说明油脂累积过程中后阶段酶的活性对菜籽含油量影响更大。因此，DGAT 、PPase是油脂累积极为关键的酶，其酶活性高低可作为高含量育种的选择指标。

表2 种子和角果皮中酶活性与菜籽含油量的相关性

注：**表示 0.01 水平上显著，*表示 0.05 水平上显著。

3 讨论与结论

含油量是当前油菜育种的一个主要育种目标，许多研究者已从遗传、生理生化和分子生物学方面研究了油菜含油量的生物学问题。本研究通过ELISA 法检测了油菜种子发育过程中ACCase、G6PDH、PPase、DGAT酶活性变化，发现不管是含油量高的油菜，还是含油量低的油菜，在种子和角果皮中4种关键油脂合成酶的酶活性变化基本一致，在中期角果中达到最高值，即38DAF左右的角果。这与唐湘如等[8]、徐一兰[9]和戚维聪[10]的研究结果一致，但代柳婷[11]的研究结果表明高含油量品种在40DAF低含油量品种在45DAF时PPase酶活性达到最高。本研究还发现油脂合成酶的酶活性高低对油菜含油量的影响非常大，酶活性高的品种或品系其含油量也高，酶活性低的品种或品系其含油量也低，特别是后期酶活性酶活性和角果成熟期的长短对油菜含油量的影响更大。这与前期研究者的研究结果基本一致。此外，在油脂累积过程中不同酶的酶活性对油菜含油量的影响是不一样的，越是后期的酶影响就越大，种子中DGAT、PPase、G6PDH的酶活性与油菜含油量的相关性最大，达到极显著水平，是油脂合成最为关键的酶，但角果皮中酶活性对油菜含油量有影响，没有达到显著水平。

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Influence on Seed Oil Content by Activities of Several Key Enzymes in Oil Synthesis of the Brassica napus

Liu Xianghan1Tang Tianxiang1Sun Chao1Sui Libo1Zhang Hui1Zhang Chuanli2Li Liping3Lin Liangbin1
(College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agriculture University1, Kunming 650201) (College of Tropical Crops, Yunnan Agriculture University2, Puer 665000) (Experimental Teaching Center for Agricultural Profession Course, Yunnan Agriculture University3, Kunming 650201)

Withbrassicanapusvarieties or strains with different oil contents as experimental materials, the activity of four key enzymes in the process of oil accumulation, namely, acetyl-coa carboxylase (accase), glucose-6-Phosphate dehydrogenase (G6PDH), phospha-tidic acid phophyhydrolase (ppase), and diacylglycero-lacyl transferase(DGAT), were detected by ELISA methods in seed and pod peel at different developmental stages, and the correlation between enzyme activity and seed oil content was analyzed. The results indicated that the variation trend of enzyme activities in seeds and pod peel of rapeseed cultivars with different oil contents was basically the same. The enzyme activity was increased rapidly from the 17th day after flowering (DAF) to the 24th DAF, and reached the peak at the 38th DAF, then it was decreased gradually. However, the enzyme activity was decreased rapidly in Huayou 8 with shorter pod ripening time of 40.2 days, earlier than the other three varieties by a week. The correlation analysis showed that the activities of DGAT, ppase and G6PDH in seeds were extremely significant positively correlated with the seed oil content, the activities of accase were positively correlated with the seed oil content, While the activity of accase, G6PDH, ppase and DGAT in pod peel was positively correlated with the oil content of rapeseed, which did not reach the significant level. The correlation levels of the four kinds of enzymes with oil content in order were as follows: DGAT, ppase, G6PDH and accase. Therefore, the gene expression level and enzyme activity level of DGAT and Ppase genes in oil accumulation should be considered during the breeding of high oil content rapeseed varieties.

brassicanapus, oil content, accase, G6PDH, ppase, DGAT

S565.4

A

1003-0174(2017)12-0100-05

973计划(2015CB150206)

2016-12-19

刘祥含，男，1991年出生，硕士，油菜生理生化

林良斌，男，1963年出生，教授，油菜分子生物学与育种