包装饮用水中铜绿假单胞菌污染控制及生产加工工艺改进

□ 张 丽 张继红 言 剑 张建辉 周彬彬 宋 晟 湖南省食品质量监督检验研究院

水乃生命之源，是人们日常生活中不可获取的物质之一。随着人民生活水平的提高，越来越多的人选择且习惯饮用包装饮用水。自2015年5月24日，GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》[1]实施，增加了铜绿假单胞菌的限量要求以来，食品药品监管部门监督抽检结果显示，包装饮用水中铜绿假单胞菌的检出率一直居高不下。

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa, PA），是一种条件致病菌，广泛分布于各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等[2，3]，易在潮湿的环境存活，对干燥、消毒剂、紫外线等具有较强的抵抗力，对多种抗生素不敏感，甚至还可以导致新菌株的出现，对于抵抗力较弱的人群存在健康风险。因此，世界卫生组织（WHO）建议免疫力低下人群不宜直接饮用瓶装水[4]。据报道，铜绿假单胞菌可产生多种外毒素、内毒素等治病因子，是导致急性肠道疾病和皮肤炎症的致病菌[5，6]，同时，因其具有天然耐药能力，在特定条件下，它还可以引起继发感染或混合感染的慢性炎症，引发肺炎、脑膜炎、败血症等严重急性感染[7]。目前，国内已有因铜绿假单胞菌污染饮用水导致中毒事件发生的报道[8-11]。

鉴于铜绿假单胞菌可能造成的危害，美国、加拿大、日本、欧洲各国以及世界卫生组织/粮农组织（WHO/FAO）等均限定瓶（桶）装饮用水铜绿假单胞菌3MPN /100 mL或者每250 mL中不得检出，我国GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》也规定每250 mL中不得检出（采用二级取样，n=5，c=0，m=0，单位 CFU/250 mL）[1]。

由于部分企业不清楚污染来源也缺乏查找污染来源的手段，所以一直找不到解决措施，给生产和监管带来了很大的困扰。为解决这一技术问题，本研究首批调研了2家湖南省内重点饮用水生产企业，查找生产工艺中有可能出现污染的风险点，提出风险防范措施，确定关键控制点，改进工艺，并进行系统监测，验证了整改效果。

1 材料与方法

1.1 样品来源

湖南省2家包装饮用水企业的水源水、各工艺环节水样、包装桶各50批次。

1.2 试剂与仪器

CN琼脂、乙酰胺肉汤、金氏B（King’s B）培养基、营养琼脂、氧化酶试剂、绿脓素测定用培养基、钠氏试剂等均由北京陆桥技术股份有限公司提供。

紫外线杀菌器：广州市水鼎水处理有限公司。

1.3 检验方法

按和GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[12]铜绿假单胞菌—滤膜法进行检验。250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂选择性培养基上，于36±1 ℃恒温箱中培养48 h，观察滤膜上菌落的生长情况。依据表1进行铜绿假单胞菌菌落选择与鉴定，计数3种典型菌落形态之总和，结果以CFU/250 mL计。

1.4 生产工艺流程

包装饮用水生产工艺流程[13]如图1所示。

2 结果与讨论

铜绿假单胞菌极易粘附于管道、滤膜、出水槽以及增压泵中繁殖，简单的冲洗和常规的消毒都难以对其进行清除。在使用各种消毒剂发挥自身优势杀灭病原微生物的同时，应尽量减少毒副产物的生成，同时保证过滤/纯化装置的正常运转。为达到理想的消毒效果，我们探索有效的消毒方式对水以及生产装置进行处理。

表1 在CN琼脂上生长的菌落选择和验证

图1 包装饮用水生产工艺流程

2.1 生产过程水处理

根据包装饮用水的生产工艺，最有可能控制铜绿假单胞菌的工艺是在水源水进入粗滤之前和精滤后，在这两处设置紫外线杀菌器对水杀菌消毒，同时监测未添加杀菌装置、增加杀菌工艺当天以及放置一周后水样被铜绿假单胞菌污染的情况，源水井、粗滤前、精滤处各取100批次水样检测，结果如图2所示。

由图2可知，未安装紫外线杀菌器时，水源井、粗滤前、精滤处三处的水样铜绿假单胞菌检出率分别为12%、18%和18%，而经过了紫外线杀菌器杀菌消毒后，铜绿假单胞菌的检出率均低于10%，最低只有4%。由此可证明，在粗滤前或在精滤后用紫外线灭菌器对水样进行消毒，可有效地控制铜绿假单胞菌对水的污染，特别是在粗滤前和精滤后两道工序处都用紫外线灭菌器消毒，能更有效地杀灭铜绿假单胞菌。

2.2 包装材料处理

铜绿假单胞菌的检出与产品包装方式也有显著关系，曾有厂家从清洗消毒后的包装瓶中检出阳性菌，笔者在对抽检数据进行分析时，也发现采用一次性包装材料的瓶装饮用水比反复使用包装材料的桶装饮用水，其污染程度要小得多，据此可以确定包装材料也是铜绿假单胞菌污染水样的媒介之一。因此，强化包装的清洗消毒工作，尤其是对重复使用的大塑料桶内壁，必须进行严格的消毒清洗，并需要防止水流冲洗过程中铜绿假单胞菌借助水雾扩散。笔者针对调研的2家企业，研究摸索了消毒剂的使用浓度和处理时间（见表2）。

表2 包装容器消毒剂选择及合适浓度

表3 包装材料清洗消毒前后铜绿假单胞菌数据

各大水厂对大塑料桶的消毒常选用氢氧化钠溶液和二氧化氯溶液，经过优化消毒剂的使用温度、浓度以及消毒时间等，得到最优的清洗大塑料桶的方案。首先用温度在60～70 ℃，浓度为3～5 mg/L的氢氧化钠溶液对内容进行清洗，冲洗48 s以上；然后再用浓度为200～300 mg/L的二氧化氯消毒液冲洗64 s以上，最后用纯水冲洗30 s以上，清洗掉残留的二氧化氯溶液。经过消毒处理后的塑料桶身以及瓶盖，其铜绿假单胞菌的检测结果见表3。

2.3 生产环境控制

WHO将矿泉水铜绿假单胞菌列为人类皮肤污染指示菌，说明铜绿假单胞菌容易通过交叉污染进入最终产品，这就要求在包装饮用水的加工生产中，严格防止交叉污染。铜绿假单胞菌在利用水流甚至气溶胶传播时，比其他微生物更有优势，因此，为了防止和控制铜绿假单胞菌的污染，除了控制加工中的污染外，保证加工环境、设备和器具的清洁卫生也是控制终产品是否被污染的重要环节。建议洗瓶车间、灌装车间定期进行消毒处理，具体方案如下：①车间安装紫外线杀菌灯（灯管定期更换）；②每周对车间使用二氧化氯喷雾自然熏蒸消毒；③设备每半个月进行消毒剂喷雾擦拭；④石英砂过滤装置每半年用4 mg/L的二氧化氯溶液浸泡消毒；⑤活性炭和反渗透膜按处理能力的要求及时进行更换。

2.4 加工过程消毒控制

在包装饮用水的生产加工过程中，除了上述环节需要严格控制外，源水井、源水箱的出口以及精滤处也极易被污染。本文分别研究了源水井、源水箱出口、精滤处三处日常消毒的频率，根据三处水样检出铜绿假单胞菌的情况以及实际的可操作性，确定了消毒的频率（见表4），要求源水井15天至少消毒一次，源水箱的出口以及精滤处每周消毒一次。在此情况下，可大幅减少水样被铜绿假单胞菌污染的情况出现。

2.5 人员控制

生产人员的卫生状况也是终产品是否被污染的因素之一，这就要求所有的生产人员必须严格按照规范要求进行生产活动，必须经过洗手更衣后方能从员工通道进入生产车间。同时，要求要有脚踏消毒池、洗手液洗手、酒精喷淋消毒，进入灌装车间更是要有更衣风淋措施，避免人体带入病菌造成交叉感染。

3 质量控制验证

为验证对包装饮用水生产加工过程工艺改进以及消毒控制后的效果，检测5批次样品分别在生产当日、一周后、半个月后、一个月后的铜绿假单胞菌（见表5）。由表5可见，在生产工艺中加入了两道灭菌工艺后，铜绿假单胞菌污染得到了有效的控制。同时，由于对包装材料进行了行之有效的消毒处理，在桶内放置一周、半个月甚至一个月后，饮用水依然没被铜绿假单胞菌污染，保障了包装饮用水在保质期内的质量，符合GB19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》的要求。

4 结论

本研究提供了包装饮用水被铜绿假单胞菌污染的有效控制方法，经过验证表明，通过在粗滤以及灌装前加入紫外线灭菌器、对塑料桶以及瓶盖进行消毒灭菌处理，对源水井以及水箱及时消毒，能有效防止铜绿假单胞菌被包装饮用水污染。

[1]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 19298-2014食品安全国家标准 包装饮用水[S].北京：中国标准出版社,2015.

[2]王燕梅 ,唐震 ,乔昕 ,等 .江苏省桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况调查[J]. 中国卫生检验杂志 ,2015(12)：2019-2020．

[3]杨 娟,蔡 震,徐 妍.泰州市桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染监测[J].中国卫生检验杂志 ,2016(12)：1771 － 1772．

[4]牛胜田.市售瓶装水的微生物学质量及有关条例[J].国外医学：卫生学 ,1994(1)：31-34.

[5]邓梅清,张菊梅,郭伟鹏,等.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J].中国卫生检验杂志 ,2009(11)：2672-2673．

表4 加工过程消毒对控制铜绿假单胞菌污染的影响

表5 工艺调整后不同储存时间效果验证

[6]马群飞,林坚,陈美兰,等.饮用天然矿泉水水源铜绿假单胞菌污染调查[J].环境与健康杂志 ,2001(3)：157-159.

[7]魏磊,吴清平,张菊梅,等．矿泉水和山泉水中铜绿假单胞菌污染调查及分离菌株毒力基因与耐药性分析[J].微生物学通报 ,2015(1)：125-132.

[8]黄淑华,陈磊,张春艳,等.从市售桶装饮用水中同时检出铜绿假单胞菌和成团泛菌[J].中外医疗 ,2014(5)：182-183．

[9]陈 松 ,李 红 ,李 德 华 ,等 .桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况分析[J].现代预防医学 ,2015(6)：1129-1130．

[10]王燕梅,唐震,乔昕,等.江苏省桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况调查[J].中国卫生检验杂志 ,2015(12)：2019-2020．

[11]沈瑛,杨正林,岳凤．食物中毒标本中检出铜绿假单胞菌[J]．浙江预防医学 ,2010(3)：45-46．

[12]国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局.GB 8538-2016 食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法[S].北京：中国标准出版社,2017.

[13]瓶（桶）装饮用水类生产许可证审查细则.