基于线粒体DNA D-loop序列的五华三黄鸡遗传多样性及其品种起源研究

黄勋和，余哲琪，翁茁先，3，温金星，李威娜，钟 鸣，唐亚东，钟福生

（1.嘉应学院生命科学学院，广东 梅州 514015；2.广东省五华三黄鸡科技创新中心，广东 梅州 514015；3.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；4.五华县田家炳中学，广东 梅州 514400；5.广东客家黄畜牧有限公司，广东 兴宁 514571）

家鸡是迄今分布最为广泛的驯养动物之一，为人们提供了稳定的蛋白质来源，同时在娱乐（斗鸡）、装饰（羽毛）、宗教（祭祀）等人类活动中起着重要作用［1］。地方家禽遗传资源是生物多样性的重要组成部分，是长期进化过程中遗留下来的宝贵财产［2-3］。五华三黄鸡是优良的地方鸡种，主要分布在广东省梅州市五华县［4-5］。五华三黄鸡具有悠久的饲养历史，因其肉质肥嫩鲜美、高蛋白、低脂肪而深受当地人们的喜爱。由于资源保护意识相对薄弱、外地优势鸡种和商品鸡的冲击以及人们消费观念的转变，该品种的种群数量正不断减少，遗传资源保护形势严峻［5］。为科学保护和合理利用五华三黄鸡品种资源，嘉应学院对五华三黄鸡品种资源、品种特性、保种选育、健康养殖、品种起源等方面进行了系统研究，取得了较大的进展［5-15］。

动物线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）因结构简单、含量丰富、突变速率快、母系遗传等特点，自20世纪90年代开始，被广泛应用于追溯家鸡的驯化历史［16］。黄勋和等［17］采用PCR产物直接测序法对五华三黄鸡丰华和太和两个群体的mtDNA 控制区全序进行了分析并构建系统进化树，结果表明五华三黄鸡与中国红原鸡亲缘关系最近。随后测定了mtDNA基因组全序列并进行了系统进化分析，结果也支持控制区全序的分析结论［15，18］。运用微卫星标记研究表明五华三黄鸡保留着较高的遗传多样性水平［12-14］，但基于mtDNA D-loop的群体遗传学研究则尚未开展。本研究应用mtDNA D-loop序列对五华三黄鸡进行遗传多样性分析，评估保种选育效果，检测种群遗传动态，同时探讨品种的历史渊源，为五华三黄鸡的科学保护和合理开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的120份血液样品采自五华三黄鸡保种场，采集时间为2016年9月。随机选取保种群体个体于肱静脉取血，置于终浓度70%乙醇中-80℃保存。采用血液DNA小量提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）提取基因组DNA，-20℃保存备用。同时在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下载中国其他地区和东南亚、南亚家鸡以及红原鸡的D-loop序列。

1.2 PCR扩增与序列测定

PCR扩增mtDNA D-loop引物：L16750，5'–AGGACTACGGCTTGAAAAGC–3'［19］；H522，5'–ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG–3'［20］。反应体系为30 μL，包括10×扩增缓冲液（含Mg2+）3 μL，4种dNTP混合物（2.5 mmol/L）2.4 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，模板DNA 1 μL，rTaqDNA聚合酶（5 U/ μL）0.3 μL，灭菌ddH2O 22.7 μL。反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s、63℃复性1 min、72℃延伸50 s，35个循环；最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认后，送往广州艾基生物技术有限公司使用扩增引物进行双向测序。

1.3 序列分析

用Bioedit［21］软件对测序序列进行人工校对，用ClustalX 1.81［22］软件进行序列比对，然后以红原鸡mtDNA D-loop序列（GenBank登录号：NC_007235）作为参考序列，使用DnaSP 5.1［23］软件定义单倍型，提取变异位点（Variable sites，V），计算核苷酸多样性（Nucleotide diversity，π）、核苷酸差异均数（Average number of nucleotide differences，K）、单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd）以及中性检验。用MEGA 6.0［24］软件分析其碱基组成，Kimura 2-parameter（K2P）模型计算群体间的遗传距离，采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建五华三黄鸡单倍型与其他家鸡及红原鸡单倍型的无根邻接树。单倍型类群的命名参照文献［25-26］。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

除去引物序列，共获得520 bp mtDNA D-loop序列，其中碱基T、C、A、G的平均含量分别为30.1%、29.9%、27.4%、12.6%，T+A的平均含量为57.5%，C+G的平均含量为42.5%。 120份样品共检测到33个突变位点，占总分析位点的6.35%；其中简约信息位点19个，单一位点突变14个。突变类型均为转换，包括23个T＞C转换和10个A＞G转换。以NC_007235作为参考序列，在33个突变位点中定义了32种单倍型，包括独享型单倍型19个，共享型单倍型13个，其中B01为优势单倍型，B20居第2位（表1）。总体单倍型多样性为0.913 ± 0.012，核苷酸多样性为0.01298 ± 0.00051，核苷酸差异均数为6.750，单倍型遗传距离为0.013 ± 0.003（表2）。其中单倍型类群B的遗传多样性最高，E次之，C最低。中性检测显示Fu’sFs值差异显著，而Tajima’s D值差异不显著；但独立检测发现除单倍型类群A外，其他单倍型类群的D检验均显示差异显著。

表1 五华三黄鸡mtDNA D-loop单倍型及其在不同地区的共享单倍型数量

（续表1）

表2 五华三黄鸡单倍型类群遗传多样性统计

2.2 系统进化分析

以家鸡和红原鸡的390种代表单倍型与五华三黄鸡的32种单倍型构建无根邻接树。无根邻接树分化为13枝（A、B、C、D、E、F、G、H、I、W、X、Y和Z），五华三黄鸡单倍群主要分布在A、B、C和E 4枝中（图1），对应的频率分别为5%（6/120）、52.5%（63/120）、16.67%（20/120）和25.83%（31/120），B为优势单倍型类群。此外，统计了2 299只中国家鸡的单倍型，其中与五华三黄鸡单倍型类群A共享的单倍型有341个，与B共享的有495个，与C共享的有117个，与E共享的有216个。将广东省及周边地区划分为华东、华北、华中、华南、西南5个区域，从表1可见，与五华三黄鸡共享单倍型最多的是西南地区、约占38.12%，华东地区次之（28.38%），第三是华中地区（19.32%），第四是华南地区（9.15%），最后是华北地区（1.62%）。

2.3 进化支的地理分布

在3700只家鸡和红原鸡中，A、B、C和E进化枝在大部分地区都有分布，其中B为优势单倍型类群，约占总数的29.19%，A次之，占总数的22.27%；进化枝D、F、G只分布在部分地区，进化枝H、I、W、X、Y和Z仅在少部分地区特有（表3）。由此可见，家鸡和红原鸡呈现出地理分布特征，部分地区还具有相似的单倍型类群组成。相比之下，江西省、云南省、东南亚、南亚家鸡，东南亚红原鸡拥有更丰富的遗传变异。

图1 390种家鸡和红原鸡单倍型与32种五华三黄鸡单倍型构建的无根邻接树

表3 家鸡和红原鸡主要进化枝的地理分布

3 结论与讨论

本研究应用mtDNA D-loop序列研究了五华三黄鸡的遗传多样性，并探讨其遗传起源。五华三黄鸡mtDNA D-loop的C+G含量低于T+A含量，符合鸟类线粒体控制区的碱基含量组成，与其他禽类的研究报道相一致［27-30］。衡量群体线粒体DNA的突变程度取决于单倍型遗传距离、单倍型多样性、核苷酸多样性和核苷酸差异均数，当遗传距离大于0.01时则被认为有较大的变异水平［31］。五华三黄鸡的遗传距离为0.01 ±0.003，单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.913±0.012和0.01298±0.00051，高于国内许多地方鸡品种，如广西6种地方鸡［32］、溧阳鸡［33］、麒麟鸡［34］。这与微卫星标记研究结论相一致［12-14］，说明目前五华三黄鸡群体遗传多样性较高，有利于后续的保种选育工作的开展。

家养动物伴随着人类的迁移而扩散至世界各地［1］。五华三黄鸡主要分布于广东省梅州市，与福建省龙岩市和江西省赣州市接壤，是粤闽赣客家地区中心之一。客家民系是从中原地区经过多次南迁，融合本地民众而成［35］。在迁移过程中，家养动物不可避免地伴随人类扩散至客家地区。五华三黄鸡独享单倍型数约占其总数的60%，说明该品种具有较为久远的饲养历史，并且与外界交流较少，仍保留着其独特的遗传特性，如尾羽和翅下为白色。中性检验发现五华三黄鸡部分单倍型类群经历了群体历史扩张，但未发现品种特有的进化枝。五华三黄鸡的单倍型组成与广东省其他地方鸡相似，也与江苏省、江西省、浙江省、东南亚家鸡接近，表明五华三黄鸡在品种形成过程中受到了人类社会活动和商品贸易的影响，品种间的遗传差异正逐步缩小。

家鸡的驯化起源自达尔文时代起就备受关注和争议［16］。mtDNA研究认为，南亚、东南亚、中国西南都可能是家鸡的起源地之一，并且经历了多次独立的驯化［25，36-39］。邻接树显示五华三黄鸡可划分为A、B、C和E 共4个单倍型类群，鉴于mtDNA具有严格遵循母系遗传的特性，可认为五华三黄鸡具有4个母系来源。五华三黄鸡品种形成受到了南迁家鸡的影响，但是否遗传起源于北方，则存在较大的争论［40-42］。将来需结合考古学、基因组学等证据深入探讨家鸡的遗传起源和扩散历史。

［1］Lawler A.Why did the chicken cross the world?［M］.G Duckworth，New York，USA，2015.

［2］Bruford M W，Bradley D G，Luikart G.DNA markers reveal the complexity of livestock domestication［J］.Nature Reviews Genetics，2003（4）：900-910.

［3］Toro M，Caballero A.Characterization and conservation of genetic diversity in subdivided populations［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society of London.Series B，Biological Sciences，2005，360：1367-1378.

［4］陈国宏，王克华，王金玉，等.中国禽类遗传资源［M］.上海：上海科学技术出版社，2004.

［5］李威娜，陈云燕，钟福，等.广东省五华三黄鸡品种资源保护与利用现状及发展对策［J］.湛江师范学院学报，2011，32（8）：132-135.

［6］钟福生，韩春艳，郑清梅，等.五华三黄鸡肉用性能及肉品质的研究［J］.嘉应学院学报，2011，29（8）：71-75.

［7］钟福生，李威娜，林伟鸿，等.五华三黄鸡生长发育规律及产肉性状分析［J］.湖南农业大学学报（自然科学版），2014，40（1）：56-59.

［8］李威娜，黄勋和，陈洁波，等.五华三黄鸡及不同品种鸡肌纤维特性与肉品质的相关性［J］.江苏农业科学，2017，45（2）：157-160.

［9］钟福生，黄勋和，周彩云，等.五华三黄鸡山地放养条件下肉用性能及肉品质的研究［J］.嘉应学院学报，2013，31（5）：67-72.

［10］李威娜，黄晓娟，钟福生，等.山地放养五华三黄鸡的屠宰性能、肉质性能及血液生化指标测定［J］.广东农业科学，2013（4）：104-107.

［11］翁茁先，李威娜，钟鸣，等.五华三黄鸡不同生态养殖模式效果评价［J］.科学试验与研究，2016（12）：1–5，45.

［12］黄勋和，李威娜，陈珊，等.五华三黄鸡群体遗传多样性与遗传结构分析［J］.中国家禽，2016，38（1）：56-58.

［13］Huang X H，Zhang J F，He D L，et al.Genetic diversity and population structure of indigenous chicken breeds in South China［J］.Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2016，3（2）：97-101.

［14］黄勋和，张金枫，谭坤凤，等.五华三黄鸡MHC-B区域复合微卫星位点LEI0258遗传多样性与进化研究［J］.广东农业科学，2016，43（6）：163-168.

［15］黄勋和，陈洁波，李婷，等.基于线粒体全基因组的五华三黄鸡系统发育分析［J］.嘉应学院学报，2015，33（8）：70-75.

［16］Lan D，Hu Y D，Zhu Q，et al.Mitochondrial DNA study in domestic chicken［J］.Mitochondrial DNA Part A DNA Mapping，Sequencing，and Analysis，2017，28：25-29.

［17］黄勋和，林雅媚，李威娜，等.五华三黄鸡线粒体DNA控制区全序列分析［J］.嘉应学院学报，2014，32（20）：58-61.

［18］Huang X H，Zhong F S，Li W N，et al.Complete mitochondrial genome of the Wuhua threeyellow chicken（Gallus gallus domesticus）［J］.Mitochondrial DNA，2016，27（2）：1311-1312.［19］Fumihito A，Miyake T，Sumi S，et al.One subspecies of the red jungle fowl（Gallus gallus gallus）suffices as the matriarchic ancestor of all domestic breeds［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91（26）：12505-12509.

［20］傅衍，牛冬，罗静，等.中国家鸡的起源探讨［J］.遗传学报，2001，28（5）：411-417.

［21］Hall T A.Bioedit：a user - friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95 /98 /NT［J］.Nucleic Acids Symp Ser，1999，41：95-98.

［22］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F.The Clustal_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］.Nuclleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

［23］Librado P，Rozas J.DnaSP v5：a software for compre-hensive analysis of DNA polymorphism data［J］.Bioinformatics，2009，25（11）：1451-1452.

［24］Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

［25］Miao Y W， Peng M S， Wu G S， et al.Chicken domestication：an updated perspective based on mitochondrial genomes［J］.Heredity， 2013，110（3）：277-282.

［26］Peng M S，Fan L，Shi N N，et al.DomeTree：a canonical toolkit for mitochondrial DNA analyses in domesticated animals［J］.Molecular Ecology Resoures，2015，15（5）：1238-1242.

［27］徐振彪，郑艳，宋林霞.芦花鸡线粒体DNA D-loop区部分片段的克隆及分析［J］.中国家禽，2008，30（14）：16-18.

［28］王欣，罗成峰，陶清海，等.拉伯高脚鸡线粒体DNA D-loop序列变异与起源分化研究［J］.中国家禽，2016，38（11）：14-18.

［29］包文斌，束婧婷，王存波，等.中国家鸡和红色原鸡mtDNA 控制区遗传多态性及系统进化分析［J］.畜牧兽医学报，2008，39（11）：1449-1459.

［30］苗永旺，孙利民，童晶晶，等.普洱毛脚乌鸡与南涧绿耳乌鸡线粒体DNA母系遗传分析［J］.家畜生态学报，2013，34（7）：10-14.

［31］Lan H，Shi L.The origin and genetic differentiation of native breeds of pigs in southwest China：an approach from mitochondrial DNA polymorphism［J］.Biochemical Genetics，1993，31（1/2）：51-60.

［32］Liao Y Y，Mo G D，Sun J L，et al.Genetic diversity of Guangxi chicken breeds assessed with microsatellites and the mitochondrial DNA D-loop region［J］.Molecular Biology Reports，2016，43：415-425.

［33］钮广林，刘靖，张跟喜，等.溧阳鸡线粒体DNA D-loop区遗传多样性研究［J］.畜牧科学，2014（9）：72-74.

［34］黄勋和，梁慧敏，陈洁波，等.基于线粒体DNA D-loop序列的麒麟鸡遗传多样性与品种起源研究［J］.嘉应学院学报，2016，34（8）：73-77.［35］房学嘉，肖文评，钟晋兰，等.客家梅州［M］.广州：华南理工大学出版社，2009.

［36］Liu Y P，Wu G S，Yao Y G，et al.Multiple maternal origins of chickens：out of the Asian jungles［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，2006，38（1）：12-19.

［37］Kanginakudru S，Metta M，Jakati R D，et al.Genetic evidence from Indian red jungle fowl corroborates multiple domestication of modern day chicken［J］.BMC Evolutionary Biology，2008，8：174.

［38］Berthouly-Salazar C，Leroy G，Nhu Van T，et al.Genetic analysis of local Vietnamese chickens provides evidence of gene flow from wild to domestic populations［J］.BMC Genetics，2009，10：1.

［39］Berthouly-Salazar C，Rognon X，Nhu Van T，et al.Vietnamese chickens：a gate towards Asian genetic diversity［J］.BMC Genetics，2010，11：53.

［40］Xiang H，Gao J Q，Yu B Q，et al.Early Holocene chicken domestication in northern China［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（49）：11564-11569.

［41］Peng M S，Shi N N，Yao Y G，et al.Caveats about interpretation of ancient chicken mtDNAs from northern China［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（16）：E1970-E1971.

［42］Peters J，Lebrasseur O，Best J，et al .Questioning new answers regarding Holocene chicken domestication in China［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（19）：e2416.