胶体金免疫层析法快速检测食品中呋喃妥因及其代谢物残留

张亚琴 陈月琴

【摘 要】本文采用胶体金免疫层析技术测定测定食品中的呋喃妥因及其代谢物残留，结果显示胶体金免疫层析法的检测限为0.5μg/kg，假阳率不大于5%，假阴率为0，研究表明胶体金试纸条法操作简便、快速、成本低，是食品中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了快速筛选方法。

【关键词】食品安全；硝基呋喃妥因类代谢物；前处理方法；结果判读

中图分类号： O657.63；TS207.5 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）27-0223-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.27.103

【Abstract】In this paper， the determination of nitrofurantoin and its metabolite residues in food was determined by colloidal gold immunochromatography. The results showed that the detection limit of colloidal gold immunochromatography was 0.5μg/kg， the false positive rate was not more than 5%， and the false negative rate was 0. Studies have shown that the colloidal gold test strip method is simple， rapid， and low-cost， and provides a rapid screening method for residue detection of nitrofurantoin metabolites in aquatic products.

【Key words】Food safety；Nitrofurantoin metabolites；Pretreatment methods；Results interpretation

0 引言

硝基呋喃类药是治疗人类和动物疾病的广谱性合成抗菌药，其价格低廉，被广泛使用，但由于它的强毒性和致癌的副作用，引起了世界各国的高度重视。这些物质无论在动物源性食品中残留多少，均会对消费者的健康带来长久的危害，故该类药物在动物源性食品中是严格禁止使用的。

在1995年，欧盟发布指令禁止在食用动物中使用四类硝基呋喃类药物，我国在2002年发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中也已经明令禁止硝基呋喃类药物。故对于呋喃类物质代谢物的研究和检测的意义就显得更为重要，同时开发该药在食品中灵敏、稳定、可靠的检测方法就显得非常必要。

作为现代四大标记技术之一的胶体金标记技术，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。免疫胶体金标记技术是以胶体金作为标志物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。近年来，该技术在医学、动植物检疫、食品安全监督等各领域得到了日益广泛的应用。本文采用胶体金免疫层析技术测定测定食品中的呋喃妥因及其代谢物残留，结果显示胶体金免疫层析法的检测限为0.5μg/kg，假阳率不大于5%，假阴率为0，研究表明胶体金试纸条法操作简便、快速、成本低，为水产中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了快速筛选方法。

硝基呋喃类药物大多为黄色结晶，难溶于水和植物油，微溶于乙醇和氯仿中，较易溶于二甲基甲酰胺。实验时欲配置一定浓度的水溶液，可先将其溶解于二甲基甲酰胺中，再用水稀释即可。硝基呋喃类药物的溶液在光照下易分解，故保存时其溶液或粉末均以避日光和荧光的照射为宜。

1 试剂的配置和样品的制备

1.1 试剂的配置

呋喃A：1份浓盐酸加35份水。

呋喃B：3.778克2-硝基苯甲醛用二甲亚砜定容至500mL，置于棕色瓶中。

呋喃C：1121.1克KH2PO4.3H2O溶于水，定容至5L，得浓缩液，按体积比，将1份浓缩液加入9份水混合均匀得呋喃C。

呋喃D：取80克NaOH，定容至1L，得浓缩液，按体积比，将1份浓缩液加入4份水混合均匀得呋喃C。

呋喃E：425克NaCl、277.15克KH2PO4.3H2O、13克KH2PO4.3H2O、25mL吐温溶解于水，溶解于水定容至5L混合均匀，的浓缩液。按体积比，将1份浓缩液加入9份水混合均匀得呋喃C。

1.2 样品的制备

从市场上购买的样品要先进预处理，鸡蛋样品可直接放于4℃冰箱保存。畜禽、水产样本洗净后，首先将其搅碎，然后转移至容器内，然后加入一定体积的水在匀浆机中匀浆，将均质后的样品置于-20℃冰箱中保存。

1.3 提取过程

称取样品（4±0.1）g于50ml离心管中，加入呋喃A试剂（1-36盐酸溶液）5ml，加入呋喃B试剂（二甲基亚砜）400微升，放在涡旋机上3000r/min，震荡2分钟。65℃水浴锅孵育30min，加呋喃试剂C（三水合磷酸氢钾）5ml，加呋喃试剂D（氢氧化钠）1ml，放在涡旋机上3000r/min，震荡1分钟。加乙酸乙酯8ml，放在涡旋机上3000r/min，震荡2分钟。4000r/min离心5分钟，取上层澄清溶液4ml于7ml离心管中，60℃氮气吹干。

1.4 样品的复溶

取已经吹干的离心管，加入2ml正己烷，震荡溶解残渣。加入呋喃试剂E（PBST）1ml，1500r/min震荡一分钟，4000r/min離心2分钟，弃上层溶液，取下层溶液待测。

2 胶体金检测卡、试纸条的制备

呋喃妥因AHD胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，可以很好的运用于动物源性食品硝基呋喃妥因类代谢物的可视化检测。呋喃妥因代谢物AHD胶体机试纸条最适条件为95-25的NC膜（硝酸纤维素膜），对样品中呋喃妥因对检测线为0.5微克/千克，金标抗体中抗体使用量为166微克，金标抗体标记量为8，将抗体稀释并缓慢加入金中，等待30分钟。加入10%BSA封闭，等待30分钟，放入冷冻高速离心机11000r/min，离心30分钟。羊抗鼠二抗稀释倍数0.3倍，抗原稀释64倍，NC膜不需要封闭处理。

取出检测卡，使用前将检测卡和代检样品恢复至室温（20℃到25℃）；（一次检测样品数量不要过多；如果检测样品过多，请分批检测），用微量移液器移取100微升待测液于加样孔中，使用计时器开始计时，室温（20℃到25℃）反应5分钟后判读结果，其它时间判读无效。

3 结果判读

阴性（-）：T（检测线）线比C（质控线）线深或一样深，表示样品中待检测物质浓度低于检测限，或不含待检测物质。

阳性（+）：检测T线比质控C线浅，则表示样品中待检测物质高于检测限。

无效：质控C线未显色；表明操作过程不正确或检测条已失效，请重新检测一次。

使用前将试纸条、微孔试剂和待检样本恢复至室温（20℃到25℃），将所需微孔试剂置于空微孔板架中；一次检测样品数量不要超过8个；如果一次检测样品数量超过8个，请按照8个一组，分批检测。用移液器移去100微升待测液于微孔试剂中，缓慢抽吸至待测也与微孔试剂充分混匀，然后开始计时室温（20℃到25℃）孵育3分钟。将标记好的试纸条使印有Logo向上，另一端向下充分浸入微孔溶液中，然后开始计时， 室温（20℃到25℃）反应5分钟，取出试纸条去掉下端样品垫并根据示意图，在1分钟内判读结果，其它时间判读无效。

阴性（-）：C（质控线）、T（检测线）线均显色：表示样品中不含有待检物或其浓度低于检测线。

阳性（+）：质控C线显色，检测T线不显色，则表示样品中待检测物浓度高于检测线。

无效：质控C线未显色；表明操作过程不正确或检测卡已失效，请重新检测一次。

4 注意事项

蓝色和绿色记号笔、水笔可能会对试验结果造成假阳性影响，所以实验过程中应避免使用。

检测试纸条请在保质期内一次性使用。

试剂使用完后请立即密封，并置于2℃到8℃避光干燥处立即保存，勿吸潮。

檢测试纸条应避光干燥处保存，切勿冷冻。

检测时避免阳光直射和电风扇直吹。

请勿使用自来水、纯化水及蒸馏水作为阴性对照。

5 小结

本文用了胶体金免疫法，研究了不同的食品中硝基呋喃妥因类及其代谢物残留。该法操作简便、快速、成本低，食品中呋喃妥因及其代谢物的残留检测提供了快速筛选方法。

【参考文献】

[1]生成选.动物源性食品硝基呋喃类药物残留调查分析与综合预防控制技术研究.

[2]王习达，陈辉，陆文浩，等.水产品中硝基呋喃类药物残留的检测与控制.