萝卜雄性不育研究进展

王俊峰　兰成云　孙杨　吕晓惠　朱娇　马蕾　韩伟

摘要：Ogura类型雄性不育是萝卜细胞质雄性不育研究最深入、最优秀的材料。本文总结了Ogura雄性不育主控基因orf138在细胞学、遗传学与分子生物学方面的研究进展，阐述了Ogura类型雄性不育在萝卜育种领域的研究现状，指明了orf138研究在今后萝卜杂交育种研究中的方向和重要意义。

关键词：萝卜；Ogura雄性不育；orf138；杂交育种；

中图分类号：S631.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0159-04

Abstract Ogura type male sterility is the most in-depth and best material for the study of cytoplasmic male sterility in radish. In this paper，we summarized the research progress of Ogura male sterility master gene orf138 in cytology， genetics and molecular biology， elaborated the research status of Ogura cytoplasmic male sterility in radish breeding field， and pointed out the direction and significance of orf138 research in radish cross breeding in the future.

Keywords Raphanus sativus L.； Ogura male sterility； orf138； Hybrid breeding

蘿卜（Raphanus sativus L.）属于十字花科萝卜属，是一种一年生或两年生的重要蔬菜。萝卜起源于我国，在长期的栽培中，形成了丰富多样的品种类型。萝卜是异花授粉作物，具有显著的杂种优势，但由于花器较小，人工去雄操作费时费力，且一次授粉获得的杂交种子很少，为解决这一问题，早期育种工作者选用自交不亲和系育种。但自交不亲和系易受环境等因素的影响，造成亲和性不稳定，经常出现制种纯度不高的现象。利用植物雄性不育系进行杂交制种，可较好地解决自交不亲和系制种的问题，提高杂交种子纯度，增加农作物产量，已成为国际种业育种的主要发展方向。

1 萝卜细胞质雄性不育类型及Ogura主控基因orf138的类型 萝卜雄性不育的研究最早起源于日本。1968年小仓在日本的鹿儿岛萝卜中首先发现了Ogura细胞质雄性不育CMS（cytoplasmic male sterility），此后科技人员对Ogura雄性不育进行了长期深入的研究。我国对萝卜雄性不育的选育及育种工作始于20世纪70年代初，山东[1]、辽宁、河南和山西[2]等地先后在萝卜地方品种中发现了雄性不育材料，随后相继开展了萝卜雄性不育育种工作，并在很短时间内就育出了杂交种，并应用于生产。后经DNA测序比对分析，我国目前发现的萝卜细胞质雄性不育材料都属于Ogura类型[3，4]。

细胞质雄性不育是一种由细胞质基因和细胞核基因共同互作形成的雄性不育现象[5]。萝卜的细胞质雄性不育一般有 Ogura-CMS （orf138）、Kos-CMS （orf125）[6]、DCGMS-CMS[7，8]和NWB-CMS[9]等类型，但最常见的还是Ogura不育类型。Ogura雄性不育不仅是迄今所知的所有萝卜雄性不育类型中在导入率和稳定性方面最优秀的不育材料，同时也是研究最为深入的一种雄性不育材料。日本学者Yamagishi通过对萝卜野生种、栽培种等不育材料进行测序，将Ogura雄性不育基因orf138分为A到I九个类型[10]。据有关资料研究，虽然不同类型间碱基发生了变异，有的还导致氨基酸发生了变化，但A型与F型具有相同的恢复和保持关系[11，12，]，从目前已发现的不育材料看，能够明确导致雄性不育的有A、B、D、F、H型，其它类型还有待验证。

2 orf138蛋白积累与育性的关系

大多数研究者认为，Ogura类型雄性不育的主控基因为orf138 [13，14]。orf138基因存在于萝卜线粒体基因组内，其编码的蛋白位于线粒体内膜上[13，15]。orf138蛋白能够显著抑制细菌的生长，据推测orf138基因能产生对花药绒毡层线粒体活性具有一定毒性的蛋白[16]。细胞质雄性不育基因对花粉败育的机理已在水稻上有了一定研究进展。Luo的课题组曾报道，在水稻线粒体中发现了一个起源于野生稻的新基因WA352，它编码的蛋白能够与细胞核编码的COX11蛋白发生互作。WA352积累优先发生在花药绒毡层，从而抑制COX11在过氧化物代谢中的功能，进而引发绒毡层细胞的程序性死亡和花粉不育。而另外两个育性恢复基因RF3和RF4的表达又能够抑制WA352的表达，从而恢复水稻的育性。此外，在水稻野败不育系和可育株系中还发现了两个线粒体基因组单拷贝ATP合成酶基因apt6 和orfB[17]。而在萝卜中发现，orf138与线粒体基因组中具有正常功能的orfB基因共转录，产生异常转录本和翻译产物，从而在花药发育的某个时期干扰线粒体的正常功能发挥，最终导致雄性不育现象的发生[15]。orfB与小麦、高粱和玉米中的atp8基因同源性分别为95%、96%和94%。这表明，orfB也是一种ATP合成酶基因。

尽管现在对雄性不育基因造成花粉败育的机理还不明确，但是，无论是细胞质不育还是细胞核不育，也不论是哪种作物，导致不育的原因主要指向花药绒毡层的发育异常。绒毡层是花药壁的最内层，它包围在生殖细胞周围，为花粉发育提供养分，对花粉发育具有重要作用[18，19]。由于绒毡层对花粉发育的重要性，人们开始着重研究影响绒毡层发育的相关基因，并在对拟南芥雄性不育的研究中先后发现了ACOS5、A6、LTP12、LAP5、TSM1、TAP35、TAP44、A9等基因与绒毡层发育有关[20-22]。为了发现更多的与绒毡层发育相关的基因，Ma等[23]利用甘蓝NiCMS和OguCMS细胞质雄性不育、细胞核隐性雄性不育（RGMS）和显性雄性不育（DGMS）4份材料进行了花蕾的转录组研究，发现104个无花粉表达基因（non-pollen expressed genes，NPGs），这些基因绝大部分与绒毡层的发育有关，其中有22个基因之前已经进行了报道，并对5个基因进行了原位杂交荧光定位。

近年也有人開始利用小RNA进行雄性不育研究。Wei等对Ogura雄性不育大白菜的miRNA研究发现，有两个新型的miRNAs在Ogura雄性不育型的花蕾中高表达，并抑制了两个花粉发育关键基因SUC1和H+-ATPase6的表达[24]。这表明，在花蕾和花药的发育过程中，可能存在这样一个miRNA调控网络。

3 orf138与恢复基因PPR-B的关系

萝卜细胞质雄性不育的育性可以通过恢复基因来恢复。1987年何启伟利用不育系与恢复系杂交后代的分离情况推测，萝卜Ogura类型的细胞质雄性不育系育性恢复基因由位于细胞核中的两对显性基因（MS1MS1MS2MS2）所控制，恢复系基因型为SMS1MS1MS2MS2或NMS1MS1MS2MS，不育系基因型为Sms1ms1ms2ms2，保持系基因型为Nms1ms1ms2ms2（S为不育型细胞质，N为正常细胞质）[1]。

研究表明，当用恢复系与不育系进行杂交时，恢复系中的恢复基因能够产生一种PPR蛋白（pentatricopeptide repeat proteins）[11，12，25]，该蛋白能够抑制orf138蛋白在花药绒毡层的积累，从而达到育性恢复的目的。PPR是一种三角状五肽重复结构域，具有该结构域的蛋白质家族是植物最大的蛋白家族之一。目前，PPR蛋白的结构特征已经基本清楚，其序列N端大都具有线粒体或叶绿体定位序列，其后为2～27个串联重复的PPR结构域，PPR结构域之间通过形成具有结合沟的超螺旋结构结合单链RNA，在线粒体和叶绿体基因转录后加工（包括编辑、剪接、剪切、降解和翻译等）、调控细胞质雄性不育相关基因表达、参与调控胚胎形成和植物生长发育等方面发挥着重要作用[26]。研究表明，目前萝卜中已发现的与育性有关的PPR蛋白有三种——PPR-A、PPR-B 和PPR-C，但只有PPR-B在恢复油菜雄性不育育性中起作用[14]。PPR-B是一种可溶性的线粒体膜融合蛋白，能通过某种直接或者间接的方式抑制orf138的mRNA在细胞质中的翻译，从而使雄性不育系恢复育性[27]。

4 展望

尽管萝卜Ogura类型雄性不育的研究最早起源于1968年，但是近10年来，关于orf138的研究报道更多地集中在甘蓝、大白菜、油菜等作物上[28-34]，在萝卜上的相关研究报道并不多。且对于萝卜Ogura类型雄性不育的研究也主要局限于orf138蛋白积累与育性的关系、orf138与恢复基因PPR-B的关系以及影响绒毡层发育的相关基因等，orf138在萝卜雄性不育中的作用机制仍然比较模糊，没有定论。未来通过对Ogura类型雄性不育材料的创新，将进一步揭示orf138在萝卜Ogura类型细胞质雄性不育中的作用机制，为萝卜雄性不育系的杂交育种提供明确的理论支持和技术指导，同时提供新的雄性不育类型，加快萝卜育种产业的发展。通过对orf138的研究，可增强萝卜及其它利用orf138雄性不育基因作物保持系选育的针对性，使新发现的雄性不育材料尽快应用于生产，丰富萝卜的雄性不育资源，避免细胞质单一给生产带来的潜在风险。新不育源的发现，可增加萝卜保持系选育的成功率，这对今后的杂交育种具有重要意义。

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