霉菌和酵母菌检测技术的研究进展

刘 桐，刘 爽，司 南，苑 帅，任大勇，陈 萍

（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春，吉林 130118）

0 引言

霉菌和酵母菌计数用来测定食品被污染的程度，是评价食品卫生质量必不可少的指标[1]。霉菌和酵母菌的污染会导致食品营养价值下降、腐败变质。若食用被霉菌、酵母菌污染的食品，会造成肠胃不适，引起疾病发生。霉菌对于食品的最大风险能产生有毒代谢产物——霉菌毒素，引起各种急、慢性中毒，并可能致癌。因此，人们愈来愈重视食品中霉菌和酵母菌污染对人体造成的危害。在我国饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品中，把霉菌和酵母菌作为食品污染的指示菌进行监测，被列入国标GB 4789系列食品安全微生物常规检测项目之一[2]。目前国内对霉菌和酵母菌的计数检测仍采用国标的平板检测法，虽然检测结果准确，但程序复杂、检测周期过长。对当前国内外霉菌和酵母菌的检测技术现状进行综述，以期为研究出更高效的霉菌和酵母菌检测技术研究提供参考。

1 霉菌和酵母菌概述

霉菌和酵母菌都是真菌，与人们日常生活联系十分密切。霉菌不仅应用于传统的酿酒制酱和发酵食品中，在农业、纺织、食品、医药和皮革制造等领域都起着极为重要的作用。但是，有些霉菌（黄曲霉、灰绿曲霉、绿青霉等）能在食品谷物上生长并产生真菌毒素。其中，黄曲霉毒素有明显的致癌作用，严重危害消费者的身体健康[3]。常见的霉菌有毛霉菌、根霉菌、曲霉、青霉等9类。现今发现对粮食造成污染的霉菌有150多种，检测粮食中的霉菌，对于指导粮食储备、保护人类和动物饮食安全意义重大[4]。酵母菌在酿造、食品、医药工业等方面占有重要地位。酵母菌有1 000多种，与食品有关的酵母菌主要有假丝酵母、啤酒酵母、面包酵母等[5]。致病性的酵母菌含量过高会引起深部真菌感染。因此，对食品中霉菌和酵母菌数量的监测是十分必要的。

2 霉菌和酵母菌检测技术的现状

国内外目前对霉菌、酵母菌的检测方法主要有平板检测法、显色培养基计数法、WKJ-Ⅱ型微生物快速检测系统、流式细胞仪计数法和测试片法。根据GB 4789.15—2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数采用平板计数法，平板计数法是将待测样品经适当稀释之后，取一定量的稀释液接种到平板上，培养基为孟加拉红或马铃薯葡萄糖琼脂，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数，检测结果准确[6]。但平板法也有很多缺点，如需要培养时间长，霉菌前期生长缓慢，后期菌丝过度生长蔓延影响计数。

显色培养基计数法是利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物显色的原理来检测微生物的新型培养基，利用显色培养基进行微生物的筛选和分离。Zhao L等人[7]用显色培养基Candi Select 4对非白假丝酵母念珠菌属物种进行鉴别，该显色培养基特异性高，其中白色念珠菌特异性为100%，而克柔念珠菌为100%，热带假丝酵母99.8%，光滑假丝酵母95.7%。Ghelardia E等人[8]用CCA显色培养基对521株酵母菌进行分离鉴定，培养基的敏感性和特异性均超过99.4%。Yucesoy M等人[9]用Chromogenic Candida Agar，BiGGY琼脂和白色念珠菌ID2琼脂3种显色培养基推定鉴定215酵母菌株，敏感性和特异性分别为100%和100%，91%和92.7%，99.2%和92.7%。张志强等人[10]应用科玛嘉显色培养基对120份妇科门诊病人分泌物标本进行念珠菌的分离培养，与常用的沙氏培养基比较。以沙氏培养基为参照，科玛嘉显色培养基的灵敏度87.5%，特异度89%，符合率88.3%，2种培养基具有相同的检出率（χ2=0.07，p＞0.05），有很好的特异度和符合率。胡锡池等人[11]应用科马嘉显色培养基对250份样本进行酵母菌鉴定时经VITEKYBC卡确认后总的符合率94.6%。显色培养基虽然改进了传统培养基在生化鉴定方面的不足，但仍需要样品前处理和灭菌等过程，培养时间长。

WKJ-Ⅱ型微生物快速检测系统以计算机处理系统为核心，结合生物制片技术、光学显微镜、图像采集装置，用分类器进行模式识别检测出目标微生物的数量，并进行自动计数。郑东辉[12]用孔径为3 μm的混合纤维素微孔滤膜对酸奶中的霉菌和酵母菌进行富集，滴加次甲基蓝染色液染色，制成涂片后在微生物快速检测仪中进行检测。此方法检测酵母菌的检测范围为2～1×106CFU/mL，霉菌的检测范围为2～1×105CFU/mL，此方法与国标法检测结果无差异显著性。这2种方法检测结果的相关系数R2＞0.99，二者具有良好的相关性。虽然此方法检测时间短，但对操作人员要求高，后期处理复杂，成本高。

流式细胞仪是一种对细胞或生物粒子的结构、功能及相互间作用进行多参数分析的仪器检测技术。该技术无需增菌，直接对食品中的活菌数进行检测，可检测出1个活的微生物或活细胞，并在90～100min内出检测结果，已广泛应用于水、液态加工食品、饮料等行业。刘道亮等人[13]采用流式细胞技术检测饮料中的霉菌和酵母菌，流式细胞仪检测果汁样品中霉菌、酵母菌的检出限为10 CFU/mL。流式细胞仪检测霉菌和酵母菌计数与平板计数线性相关系数分别为0.999 7，0.999 9，有很好的符合性。但此方法只用于液体食品的检测，有一定的局限性。

测试片是指以灭菌滤纸、无纺布或冷水可溶凝胶等吸收培养基作为载体，将特定的培养基和显色物质附着在载体上面，通过微生物在其上面的生长、显色情况来测定食品中微生物的一种产品[14]。在戴昌芳等人[15]的研究中将顺德万家康科技实业公司生产的霉菌和酵母菌计数测试纸片与国标法检测效果进行比较，2种方法检测样品的符合率高达99.47%，统计学无显著性差异 （χ2=1，p＞0.05）。余淑冰等人[16]将锐朗霉菌和酵母菌计数测试片与国标法检测结果进行比较，霉菌和酵母菌检出结果差异无显著性（p＞0.05），总符合率96.20%。张建明等人将其实验室自主研发的测试片与3M霉菌和酵母菌计数测试片的检测效果进行了评价，2种纸片的生长率差异无统计学意义（p=0.399），2种测试片和霉菌、酵母菌的生长率均达到 0.9以上。Teramura H等人[17]将 SkYM（Sanita-kun R公司的霉菌和酵母测试片）、DRBC（NISSUI制药有限公司的孟加拉红培养基）、PYM（3M公司的霉菌和酵母菌测试片）、CDYM（NISSUI制药有限公司的霉菌和酵母测试片） 4种产品用于100种自然污染食品中霉菌和酵母菌的检测。SkYM（48 h） 与DRBC，PYM，CDYM的线性相关系数分别是 0.921，0.929和 0.947，而 SkYM（72 h） 和DRBC，SkYM，CDYM之间的线性相关系数分别为0.948，0.877和0.911。测试片法虽然成本低、检测性能好，但霉菌菌丝的蔓延和显色效果的不稳定性影响计数准确性，也需进一步研究解决这些问题。

3 霉菌和酵母菌显色计数测试片的研究

测试片是一项微生物快速检测新方法，它由上下2层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格并且覆盖有微生物生产所需的培养基，其中加入染色剂、显色剂，增强菌落的目视效果；上层是聚丙烯薄膜并加入冷水可溶凝胶。使用方法简单方便，检样直接接种测试片，适宜温度培养后计数。

霉菌和酵母菌测试片研究的关键是对霉菌和酵母菌特异选择培养基中显色剂的研究。霉菌和酵母菌有复杂的酶系统和代谢过程，有多种的显色原理与显色底物可以研究来实现对霉菌和酵母菌显色计数测试片的研究。微生物具有复杂多样的酶系统，胞内酶的种类及反应条件可作为微生物分类鉴定的重要依据。根据酶的特征设计对微生物进行快速检测的一种方法，基本原理是：在分离培养基中加入检测某些菌种的特异性酶底物，该底物为人工合成，由产色基团和微生物可代谢物质组成，通常为无色，但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色，直接观察菌落颜色即可对菌种做出鉴定，这种显色底物就是显色剂。食品中霉菌和酵母菌的计数PetrifilmTM测试片法中添加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸为指示剂。SkYM测试片中添加2-（2-甲氧基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四氮唑为显色剂，使霉菌和酵母菌生成红色菌落[17]。吴清平等人也做了相关研究。在Albicans ID琼脂平板上，该显色培养基加入特异性显色底物己糖胺，白假丝酵母呈现光滑的蓝色菌落。CDA显色培养基，加入显色底物VLPA-GLcNAC 0.32 g/L。检测原理是以菌株产生的葡糖胺酶催化特异性的底物VLPAGLcNAC水解而显色。王则宇自制念珠菌显色培养基中的显色剂为N-甲吲哚-N-乙酰-β-D-氨基己糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-吡咯磷酸脂和甘氨酸-L-精氨酸-L-精氨酸-对硝基萘胺。通过这3种显色底物的联合使用，可以有效地对念珠菌直接鉴别。赵贵明研制的一种新型念珠菌显色培养基中使用的显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷，可以将都柏林念珠菌与白色念珠菌区分开。念珠菌显色培养基CCA中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基/N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐作为显色底物[8]。而霉菌与酵母菌显色计数测试片的研究还需解决酵母菌生长显色所需时间长、显色剂不能指示所有的霉菌和酵母菌菌落导致漏计等问题。

4 结语

霉菌和酵母菌的检测技术还有很大的提升空间。我国食品安全国家标准，食品微生物学检验，霉菌和酵母计数中的方法也只是平板计数。虽然国内外都建立了很多霉菌和酵母菌的检测方法，但都存在很多问题。最关键的问题是霉菌菌丝过度蔓延生长影响计数、检测周期长，这是当今和未来研究需要解决的问题。在未来是试验研究中需要不断地探索和努力来研究出更方便快捷的检测技术，才会让人类吃上安全、健康的食品，这对人类社会的发展是至关重要的。

[1]雷玲钰.食品中霉菌、酵母菌检测分析 [J].生物技术世界，2013（7）：50-51.

[2]梁美丹，肖剑，易云婷，等.食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数——检验方法比较[J].轻工科技，2015（7）：5-6.

[3]沈源.粮食中霉菌分离与鉴定方法的初步研究 [J].徐州工程学院学报（社会科学版），1997（3）：62-65.

[4]周玉庭，任佳丽，张紫莺.粮食中霉菌污染检测方法现状及发展趋势 [J].食品安全质量检测学报，2016，7（1）：244-250.

[5]王定昌.酵母菌与食品 [J].粮油食品科技，2012，20（4）：64-65.

[6]乔志文.食糖中霉菌及酵母菌的检测 [J].中国糖料，2005（3）：39-41.

[7]Zhao L，de Hoog G S，Cornelissen A，et al.Prospective evaluation of the chromogenic medium Candi Select 4 for differentiation and presumptive identification of non-Candida albicans Candida species[J].Fungal Biology，2016（2）：173-178.

[8]Ghelardi E，Pichierri G，Castagna B，et al.Efficacy of Chromogenic Candida Agar for isolation and presumptive identification of pathogenic yeast species[J].Clinical Microbiology&Infection，2008，14（2）：141-147.

[9]Yucesoy M，Ozbek O A，Oztek A O，et al.Comparison of three differential media for the presumptive identification of yeasts[J].Clinical Microbiology&Infection，2005，11（3）：245-247.

[10]张志强，李怀芳.科玛嘉培养基与沙氏培养基分离酵母菌的比较 [J].同济大学学报 （医学版），1999，20（3）：15-17.

[11]胡锡池，严子禾，王妍.应用科玛嘉酵母菌显色培养基快速鉴定酵母菌 [J].实用医学杂志，2009，25（16）：2 797-2 797.

[12]郑东辉.乳制品中细菌总数、酵母菌和霉菌快速检测方法的研究 [D].长春：吉林大学，2013.

[13]刘道亮，胡连霞，赵占民，等.流式细胞技术快速检测果汁中的霉菌、酵母菌 [J].食品工业科技，2011（8）：387-391.

[14]白阳.菌落总数测试片研究进展 [J].江苏调味副食品，2015 （2）：1-4.

[15]戴昌芳，邓峰，李玉伟，等.霉菌快速检测纸片法的研究 [J].中国公共卫生，1998，14（11）：674-675.

[16]余淑冰，梁景涛，周强忠.食品中霉菌和酵母菌纸片法与培养法检验结果的比较 [J].中国卫生检验杂志，1998（3）：138-140.

[17]Teramura H，Ushiyama M，Ogihara H.Evaluation of a novel dry sheet culture method（Sanita-kun R） for rapid enumeration of yeasts and molds in foods[J].Journal of Microbiological Methods，2015 （5） 16-19.◇