快速检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留方法的优化

胡明燕 车明秀 张艳 王骏

摘要：乙酰胆碱酯酶抑制-分光光度法是目前监管中应用最为广泛的快速筛查蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测方法。对该方法进行了多项条件的优化，结果表明，酶活性ΔA0控制在0.2～0.3时，抑制率能真实反映样品阳性结果;孵育温度是影响结果精密度的重要因素，部分仪器自带恒温装置的温控稳定性较差，比色槽温度变化较大，导致反应结果的平行性和重现性较差，试样在恒温水浴锅中的反应结果重现性很好;配制标准溶液时，应将丙酮含量控制在≤1%时，丙酮对试验的影响可以忽略。

关键词：有机磷;氨基甲酸酯;农药残留快速检测;乙酰胆碱酯酶抑制-分光光度法

中图书分类号：O656.31         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）21-0112-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.028           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The Optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for Determination of Organophosphate and Carbamate Pesticide Residues in Vegetables

HU Ming-yan1，CHE Ming-xiu1，ZHANG Yan2，WANG Jun1

（1.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250103，China;

2.Licheng Direct Food and Drug Administration of Jinan City，Jinan 250100，China）

Abstract： Acetylcholinesterase-spectrophotometry is the most widely used method for rapid detection of organophosphorus and carbamate pesticide residues in vegetables. However，in practical application，the method is seriously limited by numerous peripheral influencing factors and low accuracy. The optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for determination of organophosphate and carbamate pesticide residues in vegetables were studied in this paper.Controlling the ΔA value between 0.2～0.3 and its results were given，which could improve the accuracy of positive test results. Extra thermostatic bath was chosen instead of device came with instrument and the results showed greatly improved reproducibility and parallelism. In order to avoid the influence of acetone on enzyme activity，the added amount of acetone should be controlled less than 1% when preparing standard solution.

Key words： organophosphate;carbamate pesticide residues;rapid detection;acetylcholinesterase

有機磷和氨基甲酸酯类农药作为一类高效、广谱的杀虫剂、除草剂等正被广泛应用于农业，但大量使用后对人、动物和环境产生的危害也日益严重[1]。有机磷 （OPs）及氨基甲酸酯（CBs）类杀虫剂作为昆虫神经系统中乙酰胆碱酯酶的专一性抑制剂被筛选出来广泛应用，占杀虫剂用量的70%以上[2，3]。有机磷和氨基甲酸酯类农药对人和动物的毒性较大，绝大多数有机磷农药是剧毒的，因其可与胆碱酯酶迅速结合，形成磷脂化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去催化水解乙酰胆碱的能力，使乙酰胆碱在体内蓄积，导致神经处于过度兴奋状态而出现中毒症状[4]，而且喷洒农药还会造成生态环境污染[5]。农药的急慢性中毒，特别是果蔬食品污染后引发的群体中毒事件屡有发生[6]。因此世界各国对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留问题均高度重视，投入大量资金、人力和物力控制有机磷农药相关的安全问题。中国GB 2763-2016[7]对马拉硫磷、毒死蜱、乐果、敌敌畏等多种有机磷和氨基甲酸酯类农药有严格限量规定。

采用酶抑制法的产品是品种最多、应用最为普遍的快检技术，该类产品可以有效快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。另外速测卡法由于检验原理同酶抑制法一致，且其操作简单、成本低廉，在农贸市场、超市有很高的市场占有率。

现行有效的国家标准仅有GB/T 5009.199-2003[8]和NY/T 448-2001[9]。上述标准中规定方法为酶抑制法和速测卡法，但均为推荐标准方法，应用具有局限性，导致国内市场上农残快速检测产品品种繁多，检测效果差强人意。本研究以GB/T 5009.199-2003[8]为基础，优化检测方法，建立酶抑制法快速检测方法，通用性强且检验结果统一准确，实现对蔬菜中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速半定量分析，有效实现不同厂家快速检测产品结果的比对，满足市场监督快速筛查需求。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥98%。

丙酮（CH3COCH3）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）、碳酸氢钠（NaHCO3）、碘化乙酰硫代胆碱（C7H16INOS）。

pH 8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1 000 mL水中，混匀。

显色剂：分别取160 mg 5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。

底物：取125 mg碘化乙酰硫代胆碱，加15 mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4 ℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

乙酰胆碱酯酶4℃冰箱中保存备用。

1.2  仪器和设备

恒温水浴锅、电子天平、分光光度计或相应商品化测定仪。

1.3  原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412 nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。

1.4  方法

1.4.1  试样的提取

1）整株提取法。选取韭菜、芹菜等有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g置于表面皿中，加入10 mL缓冲液，残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2 min以上，取上清液备用。

2）整体测定法。选取油菜、菠菜等有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g放入离心管中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2 min以上，倒出提取液，静置3～5 min，待用。

1.4.2  对照液的测定  先于反应管中加入3 mL缓冲溶液，再加入适量酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37 ℃水浴锅中放置15 min。加入0.1 mL底物摇匀，立即测吸光度，3 min后再测定1次，记录反应3 min的吸光度的变化ΔA0。

1.4.3  样品液的测定  先于反应管中加入3 mL提取液，其他操作与对照液操作相同，记录反应3 min的吸光度的变化ΔAt。

1.4.4  结果判定

结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。

式中，ΔA0为对照溶液反应3 min吸光度的变化值;ΔAt为样品溶液反应3 min吸光度的变化值。

当抑制率≥50%时，表示蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留高于检测限，判定为阳性，阳性结果的样品需要重复检验2次以上。当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。

2  结果与分析

2.1  乙酰胆碱酯酶ΔA0的优化

酶抑制法的结果是样品溶液与对照溶液ΔA0的比值，因此，ΔA0对结果的准确性影响较大。对照溶液ΔA0的变化值过大或过小，有可能出现假阳性或假阴性的结果。为了考察ΔA0大小对酶抑制率的影响，本研究对比了ΔA0变化对阳性样本的影响，结果见表2。经过多次试验比较发现，仅ΔA0控制在0.2～0.3时，抑制率能真实反映样品阳性结果，其余均为假阴性结果。

2.2  恒温装置的选择

孵育温度是影响结果精密度的重要因素，部分仪器自带恒温装置的温控稳定性较差，为了考察不同恒温装置对反应的影响，本研究对比了空白溶液在仪器自带恒温装置和恒温水浴锅中的反应效果。由表3可知，自带恒温装置的吸光度相差较大，方差达到0.038，变化起伏超过平均值的16%，而使用恒温水浴装置的平行样品吸光度差距不大，方差仅为0.002。研究发现仪器自带恒温装置的温控稳定性较差，比色槽温度变化较大，导致反应结果的重现性较差，试样在恒温水浴锅中的反应结果重现性很好，因此将恒温水浴锅用于后续的试验研究。

2.3  标准测试液的选择

对有机磷和氨基甲酸酯类农药的标准物质进行考察，发现每种农药都微溶于水，易溶于丙酮，考虑到丙酮的用量对试验结果有一定影响。因此，本研究用丙酮溶解标准物质，在对照溶液中添加丙酮使其含量分别为100%、10%、5%、1%、0%，測定反应体系反应3 min后的吸光度变化值ΔA，结果见表4。由表4可以看出，随着体系中丙酮含量的增加，反应体系反应3 min后的吸光度不断降低，表明丙酮能够抑制酶促反应的进行，从而影响酶抑制率法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的结果。丙酮含量≤1%时，几乎对酶促反应没有影响，因此，配制标准溶液时，应将丙酮的含量控制在≤1%的范围里。

2.4  优化后方法的评价

采用优化后的方法由3家不同的机构对5种商品化的试剂盒进行验证，验证结果见表5。由表5可知，品牌A和品牌B两种试剂盒的验证结果性能优异，各项性能指标完全符合国家食药总局发布的《食品快速检测方法评价技术规范》（食药监办科〔2017〕43号）[10]的相关要求;其他3个品牌由于试剂盒质量的原因，性能指标不能达到国家规定的要求。

3  讨论

由于该方法在目前的监管工作中应用非常广泛，有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测产品在国家总局统计的采购量中占30%以上，主要用于农贸市场、超市、批发市场等流通领域中蔬菜和水果的快速筛查。另外由于目前市场上商品化快检试剂盒产品质量参差不齐，建议应用A类和B类快检产品对其性能指标进行考察评价，符合该方法性能指标和评价准则各项要求后方可使用。

参考文献：

[1] 刘  萍，张进忠.有机磷农药残留检测技术研究进展[J].环境污染与防治，2006（1）：55-57，71.

[2] 徐  喧.蔬菜中农药残留检测技术研究进展[J].贵州农业科学，2009，37（1）：178-181.

[3] 王金斌，谭芙蓉，王立刚，等.乙酰胆碱酯酶酶抑制法快速检测农药残留的研究进展[J].上海农业学报，2009，25（4）：131-135.

[4] 林春绵，胡晓燕，张安平.酶抑制法快速检测有机磷农药残留的研究进展[J].浙江工业大学学报，2009（4）：386-391.

[5] 陈道勇，杨  略，郭  嘉，等.有机磷农药残留的分析检测及最新研究进展[J].河南化工，2011（2）：7-12.

[6] 王小瑜.蔬菜中有机磷农药残留快速检测方法的研究[D].山东淄博：山东理工大学，2008.

[7] GB 2763-2016，食品安全国家标准  食品中农药最大残留限量[S].

[8] GB/T 5009.199-2003，蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测[S].

[9] NY/T 448-2001，蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法[S].

[10] 食药监办科〔2017〕43号，食品快速检测方法评价技术规范[S].