CRISPR/Cas9在相关皮肤病及基因治疗中的研究进展

支大龙 王刚

710032西安，第四军医大学西京皮肤医院

近年来，随着生物技术突破性的变革以及科学家们的不断探索，新技术不断涌现，推动着基因编辑的发展。传统的基因组编辑技术是以同源重组为基础对基因进行修饰，但由于构建复杂、效率低，使其应用受限。寻找新型、简易、高效的基因组编辑技术成为当今生命科学研究的新热点。人工核酸酶介导的基因组编辑技术通常是指利用人工核酸酶靶位点特异性形成DNA双链断裂，引起DNA的修复机制，从而达到基因修饰的目的，主要有以下3种：锌指核酸酶、类转录激活因子核酸酶及成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。与传统的基因组编辑技术不同，人工核酸酶技术是利用限制性内切酶对目的基因进行切割，导致DNA双链断裂，诱导其产生修复机制，从而实现基因组的定点编辑。

CRISPR/CRISPR相关蛋白（Cas）9系统是第3代基因编辑技术，相较于其他基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统构建简易，耗时短，切割效率更高，且适用于多基因同时编辑。该技术凭借其独特优势，在一系列基因治疗领域展现出极大的应用前景，如艾滋病、肿瘤、杜氏肌营养不良症等多种疾病。CRISPR/Cas9系统最初在原核生物中发现，参与免疫抵御，使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外源物质入侵的免疫能力。从Mali等［1］首次利用该系统实现基因组的编辑至今，其在包括斑马鱼［2］、大鼠［3］、小鼠［4］、非人灵长类［5］等许多物种中实现基因组的靶向编辑，很大程度上推动了生命科学和医学的研究进程。本文主要综述CRISPR/Cas9系统的研究历史、主要构成、作用机制及其在基因治疗中的应用等。

一、CRISPR/Cas9系统的研究历史、结构基础及作用机制

1.研究历史：1987年，Ishino等［6］首次发现，在大肠杆菌基因组中存在一连串短的空间间隔重复序列，这一发现在当时并没有引起科研工作者的足够关注。2000年，Mojica等［7］将此类成簇的规律间隔的短回文重复序列称为成簇的重复元件，进一步研究发现，该元件存在于40%的细菌和90%的古细菌中。2002 年，Coffey 和 Ross［8］将其正式命名为CRISPR。2005年，Mojica等［9］发现，在重复序列附近存在许多Cas的保守基因，并根据Cas基因不同将CRISPR系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。2013 年，Mali等［1］利用CRISPR/Cas9系统对小鼠基因组进行编辑，自此，CRISPR/Cas9开始作为一种新的基因组编辑技术。在基因功能、基因治疗以及构建疾病动物模型等相关生命科学和医学领域被广泛使用。

2.结构基础：CRISPR/Cas系统由多个重复序列（repeats）与非重复间隔序列（spacers）构成的R⁃S结构及编码Cas的基因操纵子组成，其中R⁃S结构能够特异性识别外源性DNA，并由类似于启动子的CRISPR前导序列起始转录生成CRISPR RNA前体。Cas基因家族负责编码具有多种功能的CRISPR相关蛋白，成熟CRISPR RNA由转录形成的CRISPR RNA前体与相关Cas蛋白的作用产生，并与tracrRNA协同作用，共同构筑细菌的免疫屏障。2011年，Wiedenheft等［10］将CRISPR/Cas9系统CRISPR RNA与反式激活crRNA的二聚体结构简化为单链向导RNA与Cas9蛋白结合形成复合体，介导Cas9蛋白与目的基因结合并切割。

3.作用机制：CRISPR/Cas9系统作用机制分为3个阶段，即获取CRISPR间隔序列、转录CRISPR RNA前体和加工CRISPR RNA、CRISPR RNA与反式激活crRNA及Cas9蛋白结合成复合体对外源性DNA进行切割，导致DNA双链断裂。此外，原型间隔序列毗邻基序（protospacer adjacent motif）也是CRISPR/Cas9系统的重要部分，为CRISPR基因座中一段高度保守序列（5′⁃NGG⁃3′）。 CRISPR/Cas9系统切割DNA后会使其双链断裂，引起DNA修复机制，实现基因编辑。DNA双链断裂会发生两种修复模式：外源同源重组模板不存在时，细胞内发生非同源末端连接修复插入或缺失，导致移码突变；外源同源重组模板存在时，可能会在细胞内发生同源重组修复。

二、CRISPR/Cas9系统在基因治疗中的应用

基因治疗指利用基因组编辑技术将致病基因纠正为正常基因，从而实现疾病的治疗。传统的基因治疗难以将致病基因精准替换为正常基因，且可能会在生物体内残留外源物质，对机体产生不良作用。目前的研究思路主要有：利用CRISPR/Cas9系统将显性致病基因切除；利用CRISPR/Cas9系统对将引起遗传病的功能基因进行切割，并引入正常的功能基因；利用CRISPR/Cas9系统使用多个单链向导RNA同时对多个致病基因切除，获得疗效。此外，CRISPR/Cas9系统也可直接用于体细胞定向基因编辑，将细胞在体外进行定向编辑，再输入患者体内，达到治疗作用。

1.疾病动物模型：2013年，Yang等［4］利用CRISPR/Cas9系统首次在小鼠中实现Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty多基因同时靶向编辑。2014年，Niu等［5］首次利用CRISPR/Cas9系统对食蟹猴基因组进行精确修饰。由于非人灵长类在生理生化、遗传背景等方面与人类高度相似，因此建立非人灵长类疾病动物模型对于研究多基因控制的复杂疾病（如帕金森氏病）有非常重要的意义。2015年，Zhou等［11］利用CRISPR/Cas9系统敲除猪胎儿成纤维细胞酪氨酸酶基因，然后通过体细胞核移植技术得到成活的酪氨酸酶基因敲除猪，该动物模型有明显的白化表型。这些研究为遗传病和代谢病等的治疗提供了较好的动物模型。

2.与诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）技术共同用于基因治疗：iPS指具有多向分化潜能以及自我再生能力的多能细胞，在疾病治疗和疾病模型构建等相关研究中有重要意义。随着基因组编辑技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统已广泛应用于修饰iPS基因组。

2014年，Xie等［12］利用CRISPR/Cas9系统成功修复了地中海贫血症患者iPS的致病基因β珠蛋白基因，并将修复后的iPS细胞继续诱导分化为正常红细胞，为地中海贫血症提供了新的治疗方法。2015年，Howden等［13］利用CRISPR/Cas9系统对两名分别患有色素性视网膜炎和重症联合免疫缺陷的患者成纤维细胞进行基因修饰，在矫正致病基因PRPF8和ADA的同时进行重编程形成iPS，将其分化为目的细胞，该研究极大地缩短了遗传性修复干细胞的获取时间，为干细胞靶向疗法提供新思路。

3.肿瘤治疗研究：目前，CRISPR/Cas9系统已应用在肿瘤研究的诸多方面。2014年，Zhen等［14］利用CRISPR/Cas9系统建立了针对引发宫颈癌的人乳头瘤病毒特异表达的E6和E7基因的编辑系统，并将其转染进入感染人乳头瘤病毒的宫颈癌细胞，细胞的增殖速率明显减缓。嵌合抗原受体T细胞是一类经过改造且能够特异性杀伤肿瘤的免疫细胞。2017年，Liu等［15］利用CRISPR/Cas9系统敲除嵌合抗原受体T细胞T细胞受体、人内源性微球蛋白及细胞程序化死亡受体1基因，发现与正常嵌合抗原受体T细胞相比，敲除上述基因的T细胞在体外及体内具有更强的肿瘤杀伤功能。同年，Chen等［16］利用CRISPR/Cas9系统将致死基因敲入癌细胞的融合基因，导致癌细胞死亡，而这种融合基因只存在癌细胞，不存在于健康细胞，极大地提高了基因治疗的特异性。

4.皮肤性病学领域：多种免疫细胞功能调节异常，导致免疫系统功能紊乱，释放大量炎症细胞因子，使机体炎症反应加重，是有些皮肤病（如银屑病、大疱性类天疱疮等）的可能发病机制之一，CRISPR/Cas9系统在免疫调节中的应用可为这类疾病发病机制的研究和治疗提供新思路。2015年，Shi等［17］利用CRISPR/Cas9系统进行全基因组筛查，证实半胱氨酸蛋白酶通过切割介导细胞焦亡的底物蛋白控制炎症坏死，而炎症坏死是先天免疫系统对病原体产生的重要免疫反应。2017年，Simeonov等［18］利用一种改进的CRISPR/Cas9系统CRISPR activation（CRISPRa）成功地找到了调控免疫细胞发育的增强子，该序列对于自身免疫疾病的发生有重要作用。

也有科研人员利用CRISPR/Cas9系统探讨黑素瘤的发病机制和治疗。2016年，Zhu等［19］利用CRISPR/Cas9系统筛选11个lncRNA位点，成功筛选出正向及负向调控人黑素瘤细胞增殖的lncRNA。2017年，Manguso等［20］利用CRISPR/Cas9系统敲除黑素瘤细胞中多个表达基因，进一步验证细胞程序性死亡配体1和CD47两个基因被删除后癌细胞更容易受细胞程序性死亡配体1阻断。

艾滋病是常见的性传播疾病，由1型人免疫缺陷病毒（HIV⁃1）损伤人T淋巴细胞导致免疫系统功能紊乱所致。近来，随着CRISPR/Cas9系统的不断发展，研究人员尝试利用该系统抑制HIV⁃1在宿主细胞内表达，甚至敲除HIV⁃1基因片段。2014年，Hu等［21］在HIV⁃1 长末端重复序列⁃U3利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，使得HIV⁃1在T细胞感染潜伏期中表达失活，同时设计多对单链向导RNA对宿主细胞进行基因编辑，将整合前病毒基因组中5′⁃3′长末端重复序列片段完全切除。2016年，Kaminski等［22］利用CRISPR/Cas9系统在活体动物基因组中敲除HIV⁃1的一段序列，从而降低HIV⁃1的感染效率。2017年，Xu等［23］利用CRISPR/Cas9系统突变肝脏造血干细胞CCR5基因，在小鼠动物模型中证明该突变有一定抵抗HIV感染的效果。同年，Yin等［24］利用CRISPR/Cas9系统使HIV⁃1的复制功能丧失，从而使HIV⁃1从被感染的细胞中彻底清除。

5.其他：随着对基因组编辑技术的深入研究，CRISPR/Cas9系统也在不断改进并应用于多个领域。2015年，Zetsche等［25］发现一种新型CRISPR系统CRISPR/Cpf1。与Cas9蛋白相比，Cpf1蛋白更小，更容易进入细胞。此外，Cpf1在切割DNA后并不是形成Cas9切割后的平末端，而是形成黏性末端，使外源基因更容易插入，而且其识别位点与剪切位置相距较远，选择编辑位置更加自由。同年，Ran等［26］在金黄色葡萄球菌中，发现一种新型Cas9酶SaCas9，与经典SpCas9相比，其基因长度减少25%，且可被装载入腺相关病毒而不影响其包装和活力，因此，提供了一个方便有效的在体基因操作工具。2017年，Kim等［27］设计出CjCas9并通过腺相关病毒将其转入小鼠肌细胞和视网膜色素上皮细胞，将黄斑变性相关的两个基因血管内皮生长因子A和血管内皮生长因子A转录因子低氧诱导因子1a敲除，从而减少脉络膜新生血管，为该病的治疗提供新的选择。单碱基基因编辑技术是在CRISPR/Cas9系统基础之上对Cas9蛋白进行改造，实现不依赖于DNA断裂而能够将DNA四种碱基A、T、G、C进行替换的编辑技术，该技术极大地提高了基因的精确修复效率［28⁃29］。

三、目前存在的问题及应用前景

与其他基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有许多优势。首先，其有更高的基因编辑效率；其次，CRISPR/Cas9系统识别靶位点仅需关注原型间隔序列毗邻基序区的3个碱基，构建方便，简单快捷［30］；最后，CRISPR/Cas9系统可以同时编辑基因组中多个基因位点，可在研究由多基因突变引起的复杂疾病中发挥重要作用。

作为一种革命性技术，CRISPR/Cas9系统仍存在不足，其中脱靶效应一直是该技术需要克服的重大技术问题。2016年，Doench等［31］对单链向导RNA结构进行优化，使CRISPR/Cas9系统的脱靶率大幅降低。同年，Ran等［32］将单链向导RNA 5′端的互补序列减少，由17或18个互补的核苷酸组成，这与未减短的单链向导RNA打靶活性相同，提高了单链向导RNA配对靶位的敏感性，同时降低了脱靶位点引起的突变效应。另外，优化Cas9蛋白结构也可降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效率。2016年，Kleinstiver等［33］通过改造高保真SpCas9蛋白使CRISPR/Cas9系统的脱靶效率显著降低，而打靶效率并未受此影响。2015年，Slaymaker等［34］通过改造Cas9酶的3个氨基酸位点，极大降低了CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。2017年，Chen等［35］突变Cas9中REC3的氨基酸残基，在减少脱靶效率的同时保持高效的敲除效率。另外，基因复杂的调控机制以及功能多样性使CRISPR/Cas9系统存在不可预知的风险，在基因编辑之前必须明确所敲除基因的功能作用，以避免出现在编辑致病基因的同时增加其他疾病的患病风险。与体细胞编辑相比，生殖细胞的基因编辑在影响个体的同时也对后代产生影响，进而可能改变其物种遗传轨迹。

随着CRISPR/Cas9系统不断的发展和完善，CRISPR/Cas9系统自身存在的一些局限性将不断被克服，相信在不久的将来该系统可以为基础研究、疾病预防和治疗等提供更加高效简单的方案。