程序性坏死调控机制及其在角质形成细胞相关疾病中的研究进展

寿艳红 杨永生 徐金华

200040上海，复旦大学附属华山医院皮肤科

皮肤角质形成细胞（keratinocytes，KC）构成了抵御微生物侵袭的第一道防线，它具有严格的增殖与分化过程，构成了表皮的各个层次。细胞凋亡是一种主动、有序、由基因控制的细胞死亡方式，适度的细胞凋亡在皮肤稳态中起重要作用。与凋亡不同，坏死被认为是不可控制的细胞死亡。随着对细胞死亡机制的不断深入研究，发现在某些情况下，坏死也是受一系列信号分子调控的、有序的过程。Degterev等［1］发现一种小分子物质Nec⁃1，能特异性阻断由死亡受体信号通路引发的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）非依赖性细胞死亡，但不影响凋亡的发生，这种能被Nec⁃1特异性抑制的细胞坏死方式被命名为程序性坏死（necroptosis）。

一、程序性坏死的调控机制

1.程序性坏死主要的启动因子：程序性坏死可由多种触发因子诱发，包括肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）、死亡受体（Fas）、TNF相关凋亡诱导配体、干扰素γ（IFN⁃γ）、脂多糖、DNA损伤、内质网应激、病毒感染等。TNF⁃α是一种多功能细胞因子，对细胞的作用复杂，并且在大多数情况下导致核因子κB（NF⁃κB）途径激活。但根据细胞种类和内环境不同，TNF⁃α也可通过与其受体结合，使TNF受体相关死亡结构域（TNF⁃receptor associated death domain，TRADD）向受体相互作用蛋白激酶 1（receptor interaction protein kinase 1，RIP1）发出信号，募集受体相互作用蛋白激酶3（receptor interaction protein kinase 3，RIP3）形成坏死体后，通过激活混合系激酶区域样蛋白（mixed lineage kinase domain⁃like protein，MLKL）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等下游因子执行程序性坏死［2］。

2.RIP1在程序性坏死中的作用：RIP1是Fas、TNF⁃α等诱导程序性坏死所需的第一个蛋白质，具有3种结构域：N末端是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶结构域，用于磷酸化并调节底物；C末端为死亡结构域，募集Fas相关死亡域蛋白（Fas⁃associated with death domain protein，FADD）和caspase⁃8；N末端和C末端之间是一段中间结构域，其靠近C末端处为同型作用结构域（RIP homotypic interaction motif，RHIM），介导同源作用，可与其他含RHIM的分子互相作用［3］。在TNF⁃α刺激下，RIP1结构域各自发挥不同的作用，参与形成复合物Ⅰ、复合物Ⅱ和坏死体，执行不同的功能。RIP1与TRADD通过死亡结构域结合后，募集TNF受体相关因子、凋亡抑制因子等构成复合物Ⅰ，该复合物通过募集NF⁃κB组成IκB激酶复合物调节剂等，导致NF⁃κB途径激活，促进炎症信号的传导。TRADD从复合物Ⅰ上解离后，募集FADD和caspase⁃8形成复合物Ⅱ，引起细胞凋亡［4］。当复合物Ⅱ中的caspase⁃8失活时，具有激酶活性的RIP1募集RIP3，并通过各自的RHIM相互作用，形成坏死体，引发程序性坏死［5］。

3.程序性坏死特异性蛋白RIP3：RIP3是RIP1的同源激酶，具有相似的N端激酶结构域，过表达时可以促成NF⁃κB活化的中间结构域；其C末端还含有RHIM结构域，但与RIP1相比缺乏C端死亡域。在敲入突变的Ripk3D161N/D161N基因小鼠中，RIP3激酶失活，程序性坏死被抑制，提示RIP3激酶是诱导程序性坏死所必需的［6］。RIP3在赖氨酸处K63泛素化可促进RIP1和RIP3通过RHIM结合［7］，导致RIP3磷酸化，从而募集下游蛋白MLKL［8］；而小鼠巨细胞病毒可以激活另一个含RHIM结构域的干扰素调节因子的DNA依赖性激活因子，与RIP3的同型RHIM相互作用，引起RIP3依赖性程序性坏死，该过程中并无RIP1参与［9］。因此，相较于RIP1，RIP3在程序性坏死中更具有特异性。

4.程序性坏死的执行者：研究发现，MLKL敲除小鼠与RIP3敲除小鼠具有相似的抵抗程序性坏死的能力［10］，提示MLKL参与程序性坏死的进程。磷酸化MLKL信号可以被Nec⁃1（RIP1激酶活性抑制剂）阻断，但不能被NSA（MLKL功能抑制剂）阻断，且RIP1信号表达不受NSA影响，说明MLKL的作用位于RIP1/RIP3的下游［11］。因此推测，MLKL是程序性坏死的执行者。MLKL是一种有激酶结构域、但无激酶活性的假激酶［12］，通过其C末端假激酶结构域结合RIP3后被磷酸化［11⁃13］。Wang等［11］分析不同时间段细胞提取物，磷酸化的MLKL开始存在于细胞质中，后逐渐在膜上出现，提示MLKL磷酸化后从细胞溶胶转移至膜上，对细胞膜进行渗透、破坏后导致细胞死亡。

MLKL下游调控机制仍不明确，除MLKL破坏细胞膜完整性的假设外，也有研究认为ROS执行细胞死亡［14］。小鼠成纤维细胞L929中，在TNF⁃α刺激下，RIP3能够激活关键代谢酶，导致能量代谢增加，随后产生大量ROS，包括O2⁃、H2O2等［14］。ROS在MLKL活化的上游和下游都起作用，一方面，ROS促进RIP1/RIP3坏死体稳定，启动正反馈扩增循环［15］；另一方面，过度产生的ROS可以损伤脂类、蛋白、DNA等，影响Ca2+浓度，引起细胞坏死。另外，活性氮、神经酰胺等也可能执行程序性坏死［16］。

二、KC及相关疾病与程序性坏死

HaCaT细胞（永生化角质形成细胞株）和原代KC中，胰蛋白酶抑制剂对硝普钠诱导的细胞死亡影响很小，而Nec⁃1可以显著降低细胞死亡，胰蛋白酶抑制剂与Nec⁃1的组合对细胞死亡具有更显著抑制作用［17］。RIP3激酶活性抑制剂或MLKL功能抑制剂都可以保护原代KC免受硝普钠诱导的死亡［18］。在HaCaT细胞、原代KC中，敲低RIP1或RIP3都可抑制硝普钠诱导的细胞死亡，而RIP3缺陷型动物中RIP1正常表达，未能检测到磷酸化MLKL［19⁃20］，说明在KC程序性坏死中RIP3位于RIP1下游，MLKL位于RIP3下游。

目前发现，程序性坏死参与多种疾病发生发展，在炎症性皮肤病中具有重要作用。炎症性皮肤病是一组复杂的、免疫介导的非传染性皮肤疾病［21］。Bonnet等［20］发现，FADD特异性敲除的小鼠发生RIP3依赖性程序性坏死和炎症性皮肤损伤，caspase⁃8特异性敲除小鼠也发展为炎症性皮肤损伤，而在这些小鼠中进一步敲除RIP3可以预防皮损［22］，说明KC程序性坏死在炎症性皮肤病中具有关键作用。研究发现，在炎症性皮肤病如扁平苔藓、红斑狼疮等中可检测到界面皮炎，其基本特征为免疫细胞浸润表皮基底膜且细胞膨胀、KC大量凋亡［23］。Lauffer等［24］发现，用扁平苔藓和红斑狼疮皮损部位T细胞上清液（T⁃cell supernatant，TCS）刺激KC，RIP3和磷酸化MLKL表达皆上调；用除去了IFN⁃γ和TNF⁃α的TCS刺激KC，未检测到RIP3和磷酸化MLKL活化；用仅除去IFN⁃γ的TCS和仅除去TNF⁃α的TCS分别刺激KC，均可见RIP3和磷酸化MLKL表达增加。由此可见界面皮炎发病机制中，除细胞凋亡之外，KC程序性坏死也发挥着重要作用，可能通过IFN⁃γ和TNF⁃α激活RIP3、磷酸化MLKL等，引起KC死亡，但仍需进一步研究。

中毒性表皮坏死松解症（TEN）以KC广泛性坏死为特征。目前认为，药物在特殊的遗传背景下激活T细胞克隆增殖，迁移至皮肤，通过直接的细胞毒作用或释放凋亡相关的细胞因子放大炎症反应，最终导致KC大量死亡［25］，死亡过程包括细胞凋亡和坏死。Saito等［26］首次用电镜发现，在TEN中KC发生的坏死是程序性坏死，小鼠实验中通过抑制程序性坏死可以完全阻断TEN样病变。Kim等［17］发现，TEN患者皮肤切片中RIP3高表达，磷酸化MLKL升高，提示可能通过RIP3表达上调，与RIP1结合后，产生ROS，激活MLKL等下游因子，引起KC程序性坏死［27］，而RIP3高表达可以引起KC对坏死刺激高敏、ROS产生、c⁃Jun氨基末端激酶（JNK）通路激活，从而加重病理过程［25］。

凋亡相关蛋白在皮肤稳态中有重要作用，可与caspase⁃8聚合形成异源二聚体，此时caspase⁃8不能启动凋亡，而是通过对RIP1 Asp324位点和RIP3 Asp328位点的切割［7］，防止RIP1/RIP3复合物形成来抑制程序性坏死［19］。在TEN/Stevens⁃Johnson综合征（SJS）患者的皮损中，凋亡相关蛋白的表皮表达显著降低，而在健康皮肤基底层高表达，由此推测凋亡相关蛋白缺失可能是TEN/SJS患者细胞大量死亡的先决条件［26，28］。由此引起的皮肤炎症可以通过中和TNF来缓解，目前TNF⁃α拮抗剂如英夫利西单抗已被用于TEN的治疗，在一些病例中显示较好疗效［27，29］。最新临床试验也表明，TNF⁃α拮抗剂依那西普改善了SJS⁃TEN患者的预后［30］。

三、展望

KC的程序性坏死已在TEN中被发现，提示曾经被认为是无法控制的细胞坏死有可能被调控。虽还未明确程序性坏死是否为TEN的罪魁祸首或继发于TEN的病理生理表现，RIP1激酶活性的抑制通常会减缓或阻止疾病进展，因此也可考虑将其应用于阻断KC大量坏死，减轻疾病严重程度［31］。此外，在小鼠模型中已发现，KC的程序性坏死对表皮的自稳有重要作用，界面皮炎发病机制的研究已证实KC程序性坏死的作用，因此在炎症性皮肤病如特应性皮炎、银屑病中，KC的程序性坏死可能是又一研究靶点。