孕牛血清早孕因子的研究进展

王晓姗

(甘肃省临泽县动物卫生监督所，甘肃临泽 734200)

早孕因子( early pregnancy factor，EPF)是1974年由澳大利亚学者Morton等，在孕鼠血清中首次发现[1]，它不但是一种妊娠相关的蛋白，而且还有其它很广泛的作用。如在超早期妊娠诊断中的应用、检测胚胎的成活情况、检测妊娠中断、分析不孕情况、肿瘤诊断和治疗方面的应用等方面的作用[2]，具有广泛的应用前景。

1 EPF的分泌来源及存在形式

1974 年Morton首次从孕鼠血清中发现EPF活性,之后世界各国的学者分别从妊娠妇女 、牛、羊、猪等妊娠动物母体血清中检测到了EPF 活性因子[3]，此后专家学者进一步分别在孕妇子宫颈黏液、男性睾丸恶性生殖细胞肿瘤患者血清、绒癌患者血清中检出EPF样活性[4]；Ito 等在牛胚胎培养液、怀孕妇女的尿液、羊胎盘提取物及老鼠卵巢和输卵管培养基等中也检测到了EPF 活性[5]；在胎牛、小牛、动情期牛及妊娠期牛血清与体外受精的牛卵细胞进行共培养实验中，发现受精卵细胞也有EPF活性；在妊娠期间淋巴细胞内蛋白合成增加，检测发现有一种具有EPF活性的分子，但更进一步研究发现，EPF主要是由卵巢和胚胎分泌产生。早期孕绒毛组织也可产生EPF，但绒毛组织产生的胎源性EPF与母源性EPF不完全相同，主要在表现花环抑制活性方面，即母源性EPF是在抑制因子参与下表现活性的，但是绒毛组织产生的EPF在无血清条件下也可表现花环抑制活性[7]。再者证实EPF的合成起始主要依赖于一个合适的激素环境，但关于EPF的分泌机制有很多不同的说法，而普遍认为EPF的产生与卵巢、输卵管、受精卵、胎盘、垂体等有关。

早孕因子在附植前有两种形式：早期的EPF是在着床前和着床期间由母体分泌的, 并且在着床前有两种形式为EPF-A和EPF-B[8]。EPF-A是由受精卵产生,EPF-B是妊娠依赖性的，由卵巢释放，是卵因子，即卵巢对垂体催乳素及精子穿透卵子时孕卵发出信号的反应，亦即受精卵产生了EPDB释放因子而非EPF-B本身，晚期的EPF是着床后由胚胎分泌的。

2 EPF本质及其特性

EPF是一种糖蛋白，耐透析、对温度、酸碱度的耐受性较强，温度<56℃时比较稳定，但是一旦超过72℃时则容易失活。目前来看，主要还是通过提纯的办法获取EPF，不同实验室对不同物种在不同孕期用不同方法分离提取的EPF，分子量都不同，在血液中提纯的EPF分子质量范围为10～450 ku不等[9]。其原因推测可能是发生某种联系，形成二聚体和三聚体等自聚形式，或者也可能携带载体蛋白，其分子存在形式较复杂，但聚合体究竟是纯化过程中形成，还是体内本身就存在，目前尚未见到详细的报道，但其基本的活性成分都是由102氨基酸残基构成。研究发现猪和牛的氨基酸序列完全相同[10]，分子质量均为10.93 ku ，等电点约为6.5，小鼠和人的EPF氨基酸序列纯合度为97%[11]，分子质量为10.96 ku，等电点约为6.8。EPF属于一个大的基因家族成员，它与细胞内蛋白- 细胞伴侣蛋白10(Cpn10)(热休克蛋白家族)高度同源[12]，但证实Cpnl0和EPF在作用机理上存在差别，主要表现在，Cpn10是在细胞内与Cpn60特异性结结合，并且辅助蛋白质正确折叠，然而EPF作为胞外蛋白发挥作用[13]，由此推测 Cpn10 和EPF只是相同基因在不同时空下表达产生的两种作用完全不同的蛋白。有人发现EPF分子的N末端必须变构(乙酰化或添加氨基酸)后才能发挥作用，而Cpn10功能发挥方面则不需要此变化，也有人发现人第1和第16染色体上有一段表达EPF/cpn10的无内含子的基因序列，并且有研究发现其表达于8条染色体上的9个不同位点[14]。目前通过蛋白酶解技术已破译了70%的EPF氨基酸序列，EPF的活性分子基础是硫氧还原蛋白(TRX) ,它发挥调节因子的作用[15]。

3 EPF的作用机制

3.1 免疫抑制作用

EPF是存在于正常妊娠血清中的一种温和的、天然的免疫抑制物，妊娠初时母体没有排斥特殊的外来物质--胚胎，这是个复杂的母胎免疫耐受调节过程，主要抑制T淋巴细胞介导的细胞免疫功能[16]，表现在T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应 反应方面，EPF结合在淋巴细胞上，刺激其产生一些可溶性抑制因子抑制淋巴细胞DNA的合成，并呈一定剂量依赖性[17]，另外就是抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖反应[18]。

EPF主要是调节CD4T细胞依赖的免疫反应作用的，抗CD4能抑制绵羊红细胞和其在T细胞上受体的相互作用[19]，十几年来，科学家发现早孕因子可从各个阶段抑制T淋巴细胞免疫应答的反应。淋巴细胞失去了协同刺激信号---一些粘附分子，如细胞间黏附分子(ICAM-1)和血管细胞黏附分子(VCAM-1)[20]，影响了淋巴细胞的活化和增殖，这也是运用玫瑰花环抑制试验检测EPF活性的原因。

3.2 生长调节作用

研究发现EPF还具有生长因子调节作用，能够促进细胞的生长，其作用不具有特异性，这种作用是在肿瘤细胞中发现的[21]。在体外培养的肿瘤细胞系中发现了EPF,与细胞生长有关，并且细胞进入分化阶段时，分泌产生的EPF明显减少，若将肿瘤细胞和EPF单克隆抗体一起培养时，肿瘤细胞的成活率会随着抗体浓度的增多而减少[22]。由此可知肿瘤的发生是由EPF免疫抑制和生长调节活性功能共同所致，况且，实验研究发现EPF还能促进受精胚胎的生长发育，以及对其进行一定的修复损伤[23]，因此EPF 的免疫抑制和生长调节活性在保证胚胎生长发育方面起着相当重要的作用。在肝细胞增生期间，EPF能够促进DNA合成和细胞分裂，由这些证据推测，EPF有可能是通过自分泌或旁分泌方式产生的一种生长因子来参与正常细胞的增殖过程[24]，但是,有关其发挥调节生长功能机制还需进一步研究探讨。

4 早孕因子的应用

4.1 在超早期妊娠诊断中的应用

目前，EPF是最早确认妊娠的生化指标之一。由于其可以在妊娠母体内最早检测到，并且具有很高的特异性，先比在怀孕大概第八天后HCG才可检测到而言，EPF作用更大，并且EPF在妊娠结束前才消失[25]，因此EPF临床应用方面引起了人们极大的关注。在小鼠受精后6 h，兔受精后16 h，大鼠、绵羊、牛、猪受精后24h，人受精后48 h ，即可在其血清中检测到EPF活性，并且在小鼠体内EPF的存在可持续至分娩前4d ,绵羊、猪体内几乎都持续整个孕期[27]，若一旦妊娠终止，血清中EPF 立即消失。EPF作为超早孕诊断指标，在孕妇血液中的检测准确率达可达88.6%，有研究发现EPF也可应用于育龄妇女的催经止孕，减少患者的心理顾虑。因此，EPF对人以及动物的超早期妊娠诊断有着重大的意义。

4.2 检测胚胎的成活情况

EPF的免疫调节作用在一定程度上决定了胎儿在母体内不被当作外来物质而受到免疫排斥，运用血清中EPF的RIT值来预测胚胎的形成及生长状态。研究发现，胚胎移植12 h，血清中即可出现EPF，在胚胎死亡或胚胎取出24～48 h内[29]，EPF随即消失，依据此状况，可用RIT检测体外胚胎的成活状况。在胚胎监控方面，通过监测孕畜血清中的EPF水平来判断孕畜是否流产、检测胚胎移植是否失败，监测妊娠母体的胎儿状态等。实验中，通过监测流产妇女在3～7 d内血清中EPF含量的变化，发现EPF呈下降趋势[30]，EPF消失说明EPF与胚胎的生长情况密切相关。在胚胎生长1～2个细胞到近着床期间，EPF对胚胎还起着的支持生长的作用。

4.3 检测妊娠中断

EPF是妊娠依赖性的，精子穿透卵子形成受精卵后，受精卵开始分泌卵因子，也叫早孕因子释放因子，该因子促使卵巢分泌EPF[31]，其分泌量与早孕因子释放因子的分泌量呈正相关，当孕畜自然流产和胚胎死亡或人工流产后，EPF分泌量都会下降。在母体怀孕期间，EPF在动物体内都发生生物活性作用，因此测定EPF活性可作为妊娠是否继续维持的重要指标。

4.4 分析不孕情况

长期以来，发现奶牛屡配不孕现象是很常见的，因此通过测定体内EPF活性，来探讨是否母牛是由于产生抗精子性不孕，还是早期胚胎的死亡造成的不孕。如果在奶牛为异常疾病情况下，正常配种后未监测到EPF活性，可以认为是受精障碍所导致；若受精后数日内EPF升高，但最终未怀孕者，可推测是已经发生了胚胎死亡。

4.5 肿瘤诊断和治疗方面的应用

近几年研究发现，在怀孕母体血清中发现有EPF活性外，在肿瘤患者血清中也发现有EPF，并且诊断恶性滋养细胞肿瘤准确率已达91.3%[32]。此外，治疗前后恶性滋养细胞肿瘤患者，抗体滴度差异较大，因此，监测患者体内EPF含量可作为诊断母细胞瘤的一种血清学指标，对其预后判断意义很大，同时EPF还可以监测患者体内是良性还是恶性的滋养细胞肿瘤也有一定意义[33]。研究发现，EPF存在可使机体更易接受肿瘤细胞，因此，我们由此判定，EPF的拮抗剂将有有益的治疗效果。孕血清中的EPF与肿瘤患者血清中的肿瘤源性EPF(t-EPF)都具有类似的分子构型和交叉免疫反应，因此,从孕血清中分离纯化的EPF抗原所制备的单克隆抗体,来测定肿瘤患者血清中的(t-EPF)，从理论上讲是可行的，有待进一步的研究。如果能够成功制作EPF单克隆抗体，酶或荧光标记后，制作靶向药物，在EPF单抗上携带药物，在细胞大量增生处，直接到达病灶来杀死恶性肿瘤细胞。

5 其他方面的应用

抗精子抗体是机体产生的，与精子表面抗原特异性结合，具有凝集精子、抑制精子从宫颈黏液向宫腔内移动，是引起动物免疫性繁殖障碍的最常见原因。EPF是一种妊娠相关蛋白，也是免疫抑制物，可抑制T淋巴细胞介导的细胞免疫，而抗精子抗体性主要也是T淋巴细胞介导的细胞免疫，因此，EPF在治疗人和动物的繁殖免疫性疾病有着重要意义。研究还发现，EPF能够预防器官移植后的排斥反应[34]，可延长移植皮肤的存活时间,也可治疗烧伤、溃疡、类风湿性关节炎等疾病。