乳腺结节硬度的分子机制研究进展

薛小伟，李俊来，万文博，李宪坤

中国人民解放军总医院 1南楼超声科 2超声科，北京 100853

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：279-283

触诊获得乳腺肿块硬度的感知不仅是肿块内部结构的特征，同时这种感知也体现肿块内部向外膨胀的物理张力，所以手法触诊所得到的信息不完全是肿块组织的生物学行为信息。1991年，Ophil等[1]首先提出“弹性成像”概念后，相关专家致力于把组织本身的硬度以图像的形式直观显示，2003年首次推出以超声探头压放为力源的应力式弹性成像[2]，2008年首次推出以声辐射力为力源的剪切波弹性成像，真正揭开了用于评价组织硬度的组织性质临床研究[3]。乳腺作为浅表器官，首当其冲成为研究的主要靶器官。乳腺癌比乳腺良性疾病和正常组织硬，从临床经验上人们普遍认同，通过近年来的弹性成像研究也证实了这一观点，而且发现胶原纤维数量的增加可能是变硬的原因[4]。但是在研究中也发现，不是所有的乳腺癌都硬，即使同一病理类型的乳腺癌，其硬度也不一定一致[5]，所以形成肿块硬度的机制研究值得进一步探讨。

ErbB2信号通路在乳腺癌细胞内硬度中的作用

ErbB2，一种跨膜受体酪氨酸激酶，是表皮生长因子受体家族的一员。ErbB2在25%的浸润性和转移性乳腺癌及许多其他肿瘤中高表达[6]。体外研究显示ErbB2能增加乳腺上皮细胞MCF10A的细胞骨架硬度并促进其转移[7]。在最硬的基质中过表达ErbB2的乳腺癌细胞可以增加细胞内硬度及细胞内对细胞外基质硬度的敏感性[8]，由此可见，ErbB2在细胞外胶原基质硬度与细胞内硬度间的机械力传导中有重要作用。细胞外基质硬度增加可导致由细胞施加的牵引力增加。细胞外基质硬度增加引起的细胞内收缩导致肌动蛋白细胞骨架硬度增加[9]。目前虽然有报道称ErbB2相关的细胞对细胞外基质硬度的敏感性与整合素及磷脂酰肌醇(- 3)激酶信号通路有关[10]，但是细胞内硬度、细胞外基质硬度与乳腺癌进展之间的关系尚无系统报道，需进一步研究明确三者之间的关系。

缺氧诱导信号在乳腺癌硬度中的作用

缺氧环境促进胶原纤维沉积，例如在皮肤损伤后，低氧促进相关的胶原纤维形成，对损伤处有明显的生物作用。在肺和心脏中，低氧环境可增加不同种类的前胶原纤维mRNA表达。乳腺癌组织学研究发现肿瘤组织中纤维化发生在低氧区并与低氧诱导转录因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF- 1)有关[11]，低氧环境可以通过肿瘤内的HIF- 1增加纤维化。

胶原纤维形成及沉积经过多个过程包括前胶原纤维合成、三螺旋形成时的脯氨酰羟基化、赖氨酸羟基化、蛋白折叠、突变和分泌，最终通过赖氨酸氧化酶完成胶原纤维间的共价交联，这些过程依次在细胞内和细胞外完成。参与这些过程中的蛋白包括脯氨酸- 4-羟化酶α1(prolyl 4- hydroxylase subunit alpha 1，P4HA1)、P4HA2、P4HA3、前胶原赖氨酸- 1、2-酮戊二酸- 5-双氧酶1(procollagen-lysine，2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1，PLOD1)、PLOD2、PLOD3及赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族等修饰[12]。

在肿瘤细胞、成纤维细胞、软骨细胞和内皮细胞中，HIF- 1可以调节P4HA1、P4HA2、PLOD1和PLOD2等的表达[13- 14]。同时LOX、LOX2、LOX4是低氧诱导的和HIF- 1调节的靶基因，它们都在胶原纤维交联和肿瘤纤维化过程中起重要作用[15]。LOX家族成员在不同类型乳腺癌中有不同程度上调。体外实验发现不同乳腺癌细胞系在低氧环境下有不同形式的LOX家族表达，但是每种形式都是HIF- 1依赖的[16]。在免疫缺陷小鼠人乳腺癌模型中沉默HIF- 1α、P4HA1或P4HA2等分子后纤维化及组织硬度减低[17]。因此，低氧诱导和HIF- 1调节的P4HA1、P4HA2、PLOD1、PLOD2和LOX家族的表达是胶原纤维形成、交联和肿瘤纤维化的重要蛋白。由此可见，HIF- 1α影响乳腺癌组织内胶原纤维合成过程，进一步影响组织硬度。

在多种细胞中HIF- 1与编码血管内皮生长因子(vascular endothecial growth factor，VEGF)、基质细胞衍生因子、血管生成素、血小板衍生生长因子B、胎盘生长因子、结缔组织生长因子和干细胞生长因子等相互作用，可以间接促进纤维母细胞生长因子表达。其中许多生长因子通过吸引成纤维细胞到原发肿瘤处和/或通过激活附近的成纤维细胞促进纤维化[18]。

组织在低氧环境下招募成纤维细胞或肌成纤维细胞到病理纤维化处。HIF- 1在原发肿瘤处分泌，促进巨噬细胞积聚，巨噬细胞很快通过改变它们基因表达形式适应缺氧环境。巨噬细胞产生生长因子如转化生长因子和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)从而激活招募的和邻近的成纤维细胞，促进胶原蛋白沉积。在低氧区，巨噬细胞通过产生转化生长因子α、转化生长因子-β1、VEGF、成纤维细胞生长因子、PDGF、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素- 8激活纤维化，这些因子可以吸引更多的巨噬细胞和间质细胞如成纤维细胞和内皮细胞，进一步激活基质细胞[19]。另有研究发现组织硬度和低氧环境通过调节整合素连接激酶(integrin linked kinase，ILK)控制乳腺癌干细胞[20]。总之，低氧信号通路涉及多种细胞类型和胶原纤维合成，对乳腺癌干细胞行为及肿瘤微环境中的细胞外基质重构有重要作用。

肿瘤相关成纤维细胞在乳腺癌硬度中的作用

成纤维细胞是结缔组织中非血管、非上皮及非炎性细胞。成纤维细胞的重要功能包括促进细胞外基质沉积、调节上皮分化、调节炎症反应及伤口愈合。肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)是成纤维细胞的一个亚群，可促进肿瘤生长和进展[21]，它们嵌入在结缔组织间负责细胞外纤维基质的合成。CAFs存在于乳腺癌和鳞状细胞癌等多种肿瘤中，并通过产生可溶性因子和促进细胞外基质重构促进乳腺癌侵袭和转移[22]。细胞外基质重构和促进肿瘤细胞侵袭都需要肌动球蛋白细胞骨架。Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)调节多种细胞骨架相关的因子表达。转录因子YAP的激活是CAFs发挥功能必需的[23]，CAFs促进细胞外基质变硬、肿瘤细胞侵袭和血管生成都需要YAP。细胞外基质变硬进一步加强YAP激活，因此形成一个前馈自我强化循环维持CAF表型。肌动球蛋白收缩和Src功能是细胞外基质硬度增加引起的YAP活化所必需的。机械力和肌动蛋白细胞骨架的紊乱导致YAP/TAZ激活[24]。

细胞因子溶血磷脂酸和转化生长因子-β可以促进细胞功能性收缩，从而促进YAP细胞核聚集，YAP激活后促进细胞外基质硬度增加，因此，细胞因子溶血磷脂酸和转化生长因子-β通过激活YAP间接导致细胞外基质重构和硬度增加[24]。相反，阻止基质重构可减少YAP活性。这些数据说明能引起细胞功能性收缩的细胞因子都可以间接激活YAP。坚硬的细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架收缩共同激活YAP，阻止细胞外基质变硬后YAP信号通路也被阻止。因此促进细胞收缩的细胞因子、YAP、CAFs、细胞外基质硬度这些要素共同组成一个正向反馈系统。

胶原蛋白排列方式在乳腺癌硬度中的作用

乳腺癌的发生与胶原纤维沉积的增加及间质胶原纤维逐渐线性化、增厚有关[25]。将乳腺癌细胞种在低氧细胞产生的细胞外基质上后，细胞排列方式高度一致并沿着细胞外基质中的纤维排列方式迁移[17]。胶原纤维排列与应变相关，研究表明胶原纤维呈直线排列后会引起基质硬度改变，当应变达到30%时胶原纤维一致性最大，排列一致的胶原纤维与随机排列的纤维相比具有更大的弹性系数。因此排列一致的胶原纤维基质改变弹性行为，导致基质硬度增加，即排列整齐的胶原纤维的弹性模量值高于随机排列的弹性模量值[26]。Rho和ROCK等分子使胶原纤维排列整齐[27]，Rho及细胞外基质指导乳腺起始细胞分化为乳腺癌细胞[28]。国内一项研究表明乳腺病灶硬度不同不仅与所含胶原纤维的量、排列方式有关，还与胶原纤维的形态有关，长直的胶原纤维导致肿瘤具有一定硬度，但是特定的排列方式导致良恶性肿瘤硬度的不同，长直形态、蜂窝状排列的胶原纤维是乳腺浸润性导管癌明显变硬的原因[5]。

总结与展望

肿瘤细胞是探索细胞外环境对细胞自动调节和细胞黏着性的目标。单个细胞的行为由细胞质中的成分[29]、周围细胞外基质施加的力[30]、连接细胞骨架与细胞外基质的整合素[31]等因素决定。虽然乳腺癌形成的分子机制和信号通路已取得重要进展，而乳腺癌细胞机械性能方面研究很少。众所周知乳腺癌组织比正常乳腺组织硬，但是关于导致乳腺癌变硬的机制尚不清楚。

本文回顾了已有的关于乳腺癌硬度机制的研究。ErbB2是感应细胞外胶原纤维硬度和细胞内硬度的重要分子，它可以增加细胞内硬度和对细胞外基质硬度的细胞内机械敏感性。低氧环境下，HIF- 1一方面招募巨噬细胞，通过产生生长因子如转化生长因子α、转化生长因子-β1、VEGF、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素- 1、白细胞介素- 8等激活纤维化，促进胶原纤维沉积；另一方面在包括乳腺癌细胞在内的多种细胞中可以直接和间接促进VEGF、基质细胞衍生因子、血管生成素、血小板衍生生长因子B、胎盘生长因子、结缔组织生长因子、干细胞生长因子、纤维母细胞生长因子[32]表达，促进纤维化及胶原纤维沉积。CAFs通过YAP活化促进细胞外基质变硬，细胞外基质硬度进一步通过肌动球蛋白收缩和Src表达激活YAP，建立一个前馈自我强化循环，帮助维持CAFs表型。排列整齐一致的胶原纤维可以增加乳腺癌细胞外基质硬度，细胞外基质硬度进一步促进胶原纤维排列一致。此外，乳腺浸润性导管癌细胞外基质中长直形态、蜂窝状排列的胶原纤维也是细胞外基质变硬的原因之一。

乳腺癌组织变硬的机制目前的研究涉及如ErbB2、HIF- 1、CAFs和细胞外基质中胶原纤维排列方式及形态等方面。鉴于微环境的广泛性，设想由生物学家、临床医生、工程师、物理学家、数学家和材料科学家等联合获得的创新将引起新的进展。

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