CD226对CD4+T细胞调节作用的研究进展①

王 宁 金敬一 姜凤良 陈丽华③

(西安医学院基础部免疫学教研室，西安 710021)

CD226(Cluster of differentiation 226)又称DNAM-1(DNAX accessory molecule-1)，最早命名为血小板/T细胞活化抗原1(PTA-1)，为免疫球蛋白超家族成员。CD226在人体主要表达于NK细胞、T细胞、单核细胞和血小板等免疫细胞膜表面，在小鼠体内主要表达于NK细胞、单核巨噬细胞、αβT细胞、γδT细胞和NKT细胞等细胞膜表面[1，2]，当T细胞激活后CD226表达上调[3]，通过与配体相互作用介导免疫细胞的分化、增殖和功能调节，并参与多种自身免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等疾病病理进程。以往研究表明：CD226对于机体免疫功能发挥至关重要的作用，参与了CD4+T细胞的增殖和分化过程；可诱导细胞毒性T细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)特异性杀伤肿瘤细胞；在特定条件下可介导血小板黏附于内皮细胞；并对NK细胞杀伤肿瘤细胞活性具有重要的调节作用。以往研究多集中CD226对于NK细胞和CD8+T细胞的免疫调控作用上，由于CD4+T细胞是介导机体细胞免疫应答的一类至关重要的细胞群，CD226对CD4+T细胞的调控势必影响着机体免疫应答格局，本文主要围绕CD226分子对于CD4+T细胞的免疫调控作用和参与疾病进程的研究进展展开综述。

1 CD226分子及其配体

CD226基因定位于染色体18q22-23，成熟分子为65 kD的跨膜糖蛋白，其胞外区有两个Ig-V样结构域，胞质区具有酪氨酸-丝氨酸磷酸化位点，T细胞和NK细胞表面的CD226在白细胞介素(Interleukin,IL)-2、IL-15和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α的作用下表达上调，在转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)-β的作用下表达下调[4]。转录因子激活蛋白1(AP-1)和Ets也可能参与了细胞膜表面CD226表达的调控。

CD226在人类以及其他一些物种间高度保守，其受体为CD112(又称Nectin-like Protein 2，Nectin-2)和CD155(又称Poliovirus Receptor，PVR/Nectin-like Protein 5，Nectin-5)，均表达于抗原提呈细胞膜表面，可竞争性与CD226结合[5]，其中CD155与CD226的亲和力高于CD112[6]，激活的T细胞表面只有CD155可被诱导表达[7]。同时，免疫抑制分子TIGIT可与CD226竞争性地结合CD112和CD155，TIGIT胞外段包含有一个免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)V样结构域，胞内段含有的免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)与受体结合后可介导负性调节信号的转导。TIGIT优先表达于调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)、激活和记忆性的T细胞，已经证实其可促进IL-10的分泌，并以此调节树突状细胞(Dendritic cells，DC)和效应性的T细胞，另外，淋巴细胞功能相关抗原-1(Lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)与表达在NK细胞和活化T细胞上的CD226有密切的联系，在免疫突触形成时，CD226与LFA-1共定位于免疫突触部位[8]，从而诱导CD226胞质区酪氨酸发生磷酸化，提示CD226可参与LFA-1共刺激信号触发。

2 CD226分子对CD4+T细胞的调节作用

T淋巴细胞所介导的细胞免疫应答是机体免疫反应的重要组成成分。研究表明，CD4+T细胞激活后其细胞膜表面CD226、TIGIT、CD155表达均增高，CD226除可参与初始CD4+T细胞的增殖和分化过程[9]、辅助性T细胞(T helper cell,Th cell)极化过程，还可参与对Treg细胞的功能调控。

2.1CD226参与了初始CD4+T细胞增殖和分化过程 研究表明CD226参与初始T细胞分化和增殖过程，并可与LFA-1协同作用诱导CD4+T细胞分泌干扰素(Interferon,IFN)γ[10]。Shibuya等[11]认为CD226协同LFA-1参与了TCR识别抗原和初始CD4+T分化的过程，他们使用慢病毒载体技术转染CD226突变株Y-F322到初始CD4+T和CD8+T细胞，发现在缺少IL-2的情况下，Y-F322可抑制CD3和LFA-1所激发的T细胞活化，相反Y-F322并不抑制CD3和CD28所激发的T细胞活化，表明CD226参与了LFA-1介导的共刺激信号来激发初始CD4+T细胞进行分化和增殖，CD226的功能类似于LFA-1激活T细胞的一个信号传导蛋白，在激活期间T细胞可分泌低水平的IL-2，如T细胞被激活并产生IL-2，就会刺激进入自分泌模式，这时CD226对于LFA-1信号介导的T细胞增殖就非必需了。同时，CD226与TIGIT竞争性结合配体CD155和CD112方式也介导了初始CD4+T细胞的分化过程。早期Yu等[12]研究显示TIGIT通过与DC表面CD155交联来提高IL-10的表达，从而达到抑制CD4+T细胞增殖的目的来发挥免疫抑制功能，近年来，Joller等[13]研究进一步证实TIGIT一方面通过募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP发挥免疫抑制效应，使CD4+T细胞分泌细胞因子和增殖能力降低，另一方面也可与CD226竞争性结合CD155来发挥抑制效应[14，15]。在Treg细胞中TIGIT基因发生了去甲基化，并可与Foxp3发生交联，所以，TIGIT+Treg细胞往往是高度激活的，可分泌可溶性的效应分子如纤维蛋白原样蛋白2来选择性地抑制Th1和Th17细胞应答[16]。

2.2CD226参与了Th1/Th2/Th17细胞的极化过程 在机体应对抗原的免疫应答中，CD4+T细胞的分化和极化影响机体免疫应答的格局，如Th1/Th2/Th17/Treg等细胞所介导的促炎/抗炎平衡及偏倚往往是决定疾病发展或转归的重要因素。体内抗CD226处理后可以明显抑制Th1细胞的表达，同时可以延迟和减少Th1介导的自身免疫性疾病如实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)的发病，提示CD226作为共刺激分子在Th1细胞激活和效应作用中均发挥着重要的作用。同时发现，给予小鼠应用CD226/Ig 融合蛋白后可以明显抑制胸腺细胞产生，特别是在胚胎胸腺器官培养中，CD4+CD8+和CD4-CD8+亚群的比例均减少[17]，进一步证实了CD226可以参与T 细胞早期分化发育过程。Shibuya等[11]研究表明，在人CD4+T细胞激活过程中，CD226可以协同参与LFA-1引起的共刺激信号来促进Th1细胞的分化。Lozano等[18]研究表明，人类CD4+T细胞激活后CD226、TIGIT和配体CD155表达均增高，TIGIT抑制T细胞的增殖，阻断TIGIT可以有效地逆转转录因子T-bet、GATA3、 IRF4 和 RORC的表达。之后他们又进一步证实CD226同配体CD155差异性表达于不同Th细胞亚群，它们在调节T细胞功能方面扮演着不同角色的作用，通过基因沉默技术证明CD226不仅可以促进Th1和Th17细胞应答，而且可以抑制Th2细胞分化和发挥功能。敲除CD226可以降低T-bet和IFN-γ的表达，促进STAT-6磷酸化和GATA3的表达并增加Th2类细胞因子IL-4和IL-13的产生，应用CD226中和抗体可以有效抑制T细胞的分化和增殖，降低IFN和IL-17的产生，但并不影响IL-13的产生[8]。这些研究结果为明确CD226在促炎(Th1/Th17)和抑炎(Th2/Treg)过程中发挥的角色作用提供了重要的参考依据，也为通过调控CD226/CD155刺激信号来干预和治疗人类自身免疫性疾病提供了重要依据。

2.3CD226对Treg细胞的调控作用 Treg细胞是维持机体免疫耐受和自身稳定的主要细胞。根据细胞发育和分化途径，Treg可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节T细胞(iTreg)，如Th3、Tr1(T regulatory 1)细胞等。nTreg的免疫表型为CD4+CD25+Foxp3+，其中转录因子Foxp3在调控nTreg的发育中起到了关键性的作用。iTreg通过分泌IL-10和TGF-β发挥免疫负调控作用。

2.3.1CD226对Foxp3+Treg细胞的调控作用 Fuhrman等[19]证实，CD226+TIGIT-Treg细胞激活后抑制能力明显减弱，分泌IL-10和效应性细胞因子能力显著性提高，当Treg激活后或在体外扩增时，TIGIT可高表达或表达上调并与细胞稳定性和抑制能力有密切关系。另外， Treg细胞上CD226表达水平也与机体的免疫状态有着密切的相互关系，Koyama 等[20]应用致死量全身照射模拟供体移植物植入机体状态来分析移植物抗宿主反应(Graftversus host reaction)或移植物抗白血病(Graft-versus-leukemia,GVL)反应，通过此实验明确了供者T细胞在骨髓移植后GVHD和GVL反应中发挥着至关重要的作用，证实了CD226可影响并决定骨髓移植后GVHD的产生，如移植物表达CD226可促进GVHD的发生，其相关机制主要为CD226可抑制移植物CD4+Foxp3+Treg细胞增殖并抑制其活性，而并非依赖效应性CD8+T细胞的方式。此外，他们还发现移植之后当患者体内Treg和效应性T细胞表面CD226和TIGIT表达增多，GVHD的发生概率更高。这些发现对于抑制CD226产生T细胞免疫耐受相关实验研究提供了理论支持，也为以T细胞激活为特点的炎性疾病治疗提供了一定的研究思路。

2.3.2CD226对Foxp3-Tr1细胞的调控作用 Tr1细胞在诱导和维持外周免疫耐受中发挥着重要的作用，其特异性的细胞因子产生情况为：IL-10+、TGF-β+、IL-4-、IL-2low、IFN-γlow[21]，Tr1的免疫表型为CD4+CD226+CD49b+LAG3+[22]。早期认为Tr1细胞主要是通过IL-10、TGF-β等细胞因子依赖方式来抑制T细胞产生免疫应答，但近年来研究发现黏附分子介导的细胞间特异性交联也可调控Tr1细胞的功能活性，Magnani等[23]研究发现：极化状态的Tr1细胞系和Tr1细胞克隆株上表达高水平的CD226，而其相关配体CD155 和CD112在髓系来源的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)上特异性表达。Tr1细胞通过IL-10方式维持颗粒酶B的表达和分泌，最终通过颗粒酶B和穿孔素途径特异性溶解髓系来源APC，这种方式需要依赖HLA(Human leukocyte antigen)-Ⅰ的识别，并需要CD54、LFA-1等黏附分子参与，值得注意的是，表达在Tr1上的CD226和APC上配体CD155交互作用介导了Tr1的激活，并且对于Tr1细胞识别靶细胞的特异性是必需的，在免疫耐受患者体内CD4+T细胞表面高表达颗粒酶B，并且这种增高与Tr1产生IL-10是正相关的，推断此种耐受建立在以CD226等黏附分子与免疫细胞上相应配体特异性交联的基础之上[24]。加入CD226单抗的P815细胞可促进Tr1细胞在颗粒酶B存在的条件下脱颗粒，然而他们不能诱导Th0细胞脱颗粒；另外，当与CD14+细胞共培养时，添加CD226单抗可以显著增加Tr1的脱颗粒现象；当CD1c+细胞作为目的细胞时也可以观察到相同的结果。这些结果均表明Tr1膜表面CD226分子可参与并介导Tr1细胞毒作用的激活。

3 CD226通过对CD4+T细胞调控参与疾病发生与发展

CD4+T细胞及其亚群在免疫应答中发挥着重要作用，其细胞膜表面分子表达变化可与多种疾病的发生、发展和预后有密切关系。既往文献报道CD226分子可通过与配体相互作用参与炎症发生过程，Manes等[8]利用阻断性单抗和RNA干扰技术发现炎症发生过程中TCR刺激人效应记忆性CD4+T细胞活化，并介导细胞间黏附过程，其中内皮细胞上的细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)与效应记忆CD4+T细胞的LFA-1结合，CD112和CD155与CD226或CD96结合，有助于效应记忆性CD4+T细胞经内皮细胞移行，进一步阐明了炎症发生时淋巴细胞募集到外周炎症部位的相关机制。同时，CD226作为共刺激分子可促进初始CD4+T细胞分化为Th1和Th17细胞，抑制向Th2细胞方向分化；当CD226及其配体相互作用可调节和参与自身免疫性疾病和移植排斥反应等病理进程。抗CD226免疫治疗后显示小鼠体内Th1细胞表达降低，并减缓Th1细胞介导的自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病[25]。另外，T细胞CTLA-4/CD86共刺激信号和CD226等位基因的变化与Ⅰ型糖尿病和多发性硬化症有密切的关系[26,27]，这些共刺激分子不仅调节T细胞激活后的功能发挥，而且其等位基因变化可通过改变活化或抑制共刺激信号平衡来增加Ⅰ型糖尿病或者类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的风险[28]。同时，研究证实 CD226和TIGIT参与的信号通路与多种自身免疫性疾病的易感性有密切关系，TIGIT与CD226竞争性地同CD155结合，其机制类似于CTLA-4 同CD80/86竞争性结合CD28，Joller等[29]研究表明小鼠TIGIT表达降低可导致T细胞过度增殖和高应答状态，并增加自身免疫性疾病风险，通过调节共刺激信号CTLA-4的表达来抑制T细胞增殖的方法已经在自身免疫性疾病临床治疗应用中得到证实，因此，通过调控TIGIT/CD226的表达来减缓Th细胞介导的自身免疫性疾病，也是一个值得深入研究的治疗操纵靶点。

另外，研究表明免疫细胞膜表面CD226参与了机体抗肿瘤免疫应答过程，其配体CD155在多种肿瘤细胞膜表面均高表达。Takahashi等[30]研究了CD226和CD155在皮肤T细胞淋巴瘤中的表达和功能，发现患者外周血中NK细胞和CD8+T细胞CD226表达下降，但血清中可溶性CD226随病情严重程度的增高，CD155在此种肿瘤细胞膜表面高表达，考虑血清中可溶性CD226来源于膜脱落方式，应用重组CD226制剂治疗后NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒作用增强。这些结果均表明 CD226在肿瘤免疫过程中发挥着十分重要的作用。

GVHD是异基因骨髓移植后主要的并发症，急性GVHD的发生以Th1型反应为主，近期研究发现CD226和CD155在GVHD中表现为相反的作用，缺乏CD226后GVHD病情减轻，增加CD155表达可促进Th2型免疫应答[31]，使GVHD病情减轻。另外，研究发现CD8+T和CD4+T细胞应答是决定GVHD严重程度主要因素，特别是供体的Foxp3+的Treg细胞，骨髓移植后CD226的缺乏会促进Treg细胞增殖和抑制功能[20]，给予小鼠预防性使用CD226抗体可减轻GVHD并降低死亡率，发生GVHD后使用单次CD226抗体即可减轻GVHD病情并延长生存时间[32]，可见，抑制CD226的表达可增强机体对T细胞激活类疾病的免疫耐受程度，这些发现为预防性的阻断CD226治疗Th1过度激活导致的炎症性疾病提供了有力的支持。

4 展望

CD226是表达于免疫细胞膜表面的重要黏附分子和共刺激分子，其与配体的相互作用是影响免疫应答和细胞毒性反应的重要因素，CD4+T细胞作为机体重要的一类免疫细胞，其分化方向受到了共刺激分子、细胞因子、抗原性质等多因素的调控。虽然已经证实CD226可调控CD4+T细胞分化来影响机体促炎和抑炎过程的平衡，进而影响多种自身免疫性疾病、炎性疾病和肿瘤的发生发展进程，但其调控机制仍有待进一步研究，同时进一步研究和深层次认识CD226调控免疫细胞和免疫应答的规律，也可为自身免疫性疾病和炎症性疾病提供新的治疗靶点。

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