疫苗稳定性方法研究进展

高帆 李克雷 吴星 徐苗 梁争论

102629北京，中国食品药品检定研究院生物制品检定所（高帆、李克雷、吴星、徐苗、梁争论），北京民海生物科技有限公司（李克雷）

疫苗是以病原微生物或其组成成分、代谢产物作为免疫原，能够诱导特定的主动保护性免疫，用于预防、治疗人类相应疾病的生物制品。疫苗稳定性是疫苗在效期内保持理化、微生物和生物学特性的能力。为保证疫苗质量，需对疫苗生产中间产物、原液、成品及运输、储存直至效期末的全疫苗生命周期进行稳定性研究。疫苗的效力随储存时间的延长及储存条件的变化而逐渐下降。根据疫苗组成成分的生物活性及理化性质的不同，疫苗的稳定性特点也存在很大差异。疫苗效力在不同储存条件下的下降曲线是制订疫苗效期、确定疫苗储运条件的主要依据。根据对热和冻结稳定性的差异，疫苗可分为热敏感性疫苗和冻结敏感性疫苗。前者主要包括减毒活疫苗，如口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV），冻干乙型脑炎减毒活疫苗等；后者主要为含铝佐剂灭活及重组病毒样颗粒（VLP）疫苗，如甲肝灭活疫苗和重组乙肝疫苗等。因此设计完善的稳定性研究方案，在研发阶段、临床试验阶段以及上市后有效评价疫苗的稳定性，是全面了解研究疫苗特性，完成上市审批以及保证上市后疫苗安全有效的基础。

世界卫生组织（WHO）于1989年首次颁布“疫苗稳定性” 文件（WHO／EPI／GEN／89.08）［1］，并在1998 年进行了修订（WHO／GPV／98.07）［2］，2006 年颁布了“疫苗温度敏感性”文件［3］，明确指出需关注冻结对疫苗质量的影响。在同年颁布的《疫苗稳定性评价指南》［4］中提出需按照不同疫苗的特点设计稳定性研究参数；在疫苗研发、临床试验、上市后监测等不同阶段均需进行稳定性评价；提出应重视稳定性研究设计、选择适当统计方法并进行合理的数据分析。为推动疫苗在冷链难以推广国家和地区的应用，2012年WHO颁布了疫苗温度控制链（CTC）指南［5］。2013年为评估扩大计划免疫疫苗稳定性，并考虑符合批准储存条件的可行性，WHO颁布了扩展控制温度条件（ECTC）指导原则，为脱冷链状态下疫苗的稳定性评价提供了指南［6］。

中国药典（2015版）三部新增的人用疫苗总论中，首次对疫苗稳定性评价进行了规定，并对疫苗贮运提出了要求［7］。国家药品审评中心（CDE）颁布了《生物制品稳定性研究技术指导原则》，对生物制品原液、成品或中间产物等的稳定性研究设计、结果分析等进行了明确规范［8］。2017年国家卫生和计划生育委员会和食品药品监管总局颁布了《疫苗运输和储存管理规范》［9］，保证疫苗在运输过程中的稳定性。同年CDE年颁布了《生物制品上市后变更研究技术指导原则（征求意见稿）》，对变更进行的相关稳定性研究提出了具体要求［10］。

1 研究目标

稳定性评价是疫苗质量和安全性监管的重要部分；稳定性研究是产品质量标准制订的基础，可用于合理选择产品生产工艺、制剂处方及包装材料，是贯穿于整个药品研发阶段和支持药品上市及上市后的研究。稳定性研究目标在疫苗各个生命周期中有所不同［3］，分别为：（1）研发阶段：确定疫苗有效期和储存条件，并支持批准上市。包括研究前期应对疫苗中间品、原液、成品等阶段各制剂处方组分的生物活性、理化性质、结构完整性进行监测。研究后期开展与器皿封闭性、完整性相关的参数研究等；（2）上市后阶段：研究上市疫苗与临床疫苗的一致性，确保上市疫苗的安全性和有效性，同时应对1批或多批疫苗进行长期稳定性监测；（3）通过阐明不同工艺制造的产品可比性支持工艺变更［4］，要求采用变更后工艺生产至少3批疫苗，与现有工艺生产的至少3批疫苗在不少于3个温度点的基础上进行比较研究。为了节约时间和避免无菌监测的假阳性结果，温度和时间的选择应根据特定疫苗的稳定性而定。加速稳定性研究的方案应按照疫苗特性变化的温度和时间而设计，并且通过检测初始时间和最终时间时疫苗稳定性参数，计算疫苗在各温度条件下的降解率。通过比较不同工艺同一温度下疫苗的降解率，评价新工艺的可行性。另外，热加速稳定性可在疫苗早期研发阶段进行，为确定有效期提供数据支持，也可协助评估疫苗在工艺变更后的稳定性，但不可用于预测疫苗的实时、真实状态的稳定性。

2 研究设计

开展稳定性研究需要科学的方案设计，合理设定检测批次、样本数量、频次和时间间隔。目前应用于药品及疫苗稳定性评价常用的时间点为3、6、9、12和18个月，但其后每6个月作为检测的时间点不一定适合所有疫苗，应依据所研究疫苗的特性选择适当的检测时间点；检测参数应选择与临床相关的、敏感的、可表征疫苗免疫原性或疗效的指标；疫苗稳定性研究过程中，不但需要考虑蛋白、多糖、脂质等疫苗的活性成分，还需同时关注疫苗的佐剂、稀释剂等制剂组分以及包装瓶、胶塞等包装材料的影响；在数据分析时应选择适宜的统计学分析方法；可通过稳定性研究数据外推定义有效期。此外，由于生物学检测的固有变异性，标准物质的制备和使用对检测的准确性和可靠性至关重要。

3 检测指标和方法

检测指标应能表征疫苗的免疫原性或疗效，以及与经临床试验证明的效力或安全性之间的联系。疫苗效价是反映疫苗质量的关键指标，也是用于考察疫苗稳定性或降解程度的重要指标。对于大多数疫苗，效价指标可反映稳定性（降解）对疫苗的免疫原性和保护效果产生的影响。根据疫苗特性的不同，效价检测方法也各不相同，包括体内效力或体外效力检测方法，应与相应疫苗批签发放行的效价检测方法一致。但体内和体外效力试验的缺点在于其往往受到多种生物变化因素的影响。除了效价，抗原含量和特定毒性也可反应疫苗的活性，可借助特异抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）得到定量检测结果。其它检测参数还包括组胺致敏试验（百日咳疫苗）、游离多糖水平、佐剂解吸、佐剂聚集等。

疫苗效价的检测方法依据疫苗的品种，以及各企业产品的特点有所不同（详见药典各论及附录）。病毒滴度半数细胞感染剂量（CCID50）的检测可用于直接研究减毒活疫苗中间品和／或成品的稳定性，如麻疹／腮腺炎／风疹（麻腮风）疫苗、OPV疫苗、冻干甲肝减毒活疫苗和流感减毒活疫苗等；对于多数灭活疫苗，效价只能用于成品稳定性的检测，如脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）、肠道病毒71型（EV-A71）灭活疫苗等；由于体外相对效力检测方法具有准确定量、重复性好和符合3R原则等优点，在得到稳定的体内效力和体外效力相关关系后，可采用体外相对效力检测方法代替体内法，如甲肝灭活疫苗和乙肝疫苗；抗原检测是依据免疫学原理，通过标记抗体以及单抗结合等方法（如ELISA法），评价疫苗抗原结构的完整性。对于肺炎多糖疫苗和结合多糖疫苗，可通过游离糖检测方法准确反映疫苗稳定性。

铝佐剂具有增强免疫效果的作用，如果在外界环境压力作用下发生解聚或聚集，可引起疫苗效力不可逆的下降［11］。WHO建立了SHAKE TEST方法用于评价疫苗冻结后质量评价。该方法通过比较冻结前后疫苗沉降率的差异，了解疫苗是否受到冷冻的损伤［12］。另外，近年来采用仪器法和免疫学方法评价疫苗稳定性的报道增多。仪器法主要检测疫苗抗原的分子大小和结构，如扫描电镜法、质谱法、流式细胞术等均可用于观察铝佐剂疫苗的聚集程度；而免疫学方法则是通过标记抗体以及单抗结合等方法评价疫苗抗原结构的完整性。

Estey等［13］采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF）结合肽图的检测方法，评价佐剂结合的肉毒杆菌三价疫苗rBoNT（Hc）蛋白抗原的化学完整性。研究表明在长期储存条件下，铝盐佐剂可影响蛋白的化学稳定性和／或化学降解路径。Feinstein等［14］为了解沙眼衣原体外膜蛋白nMOMP在稳定剂Amphipols中的结构和稳定性，应用多种光谱技术鉴别其二级（圆二色）、三级和四级结构（免疫组化和凝胶电泳），以及聚集状态（光散射）。通过核磁共振检测15N标记的nMOMP蛋白，在Amphipols中可检测到nMOMP暴露的外环结构，表明Amphipols可提高膜蛋白为组分的疫苗稳定性。 Stergaard 等［15］通过单抗标记 Gardasil® 、Silgard®和Cervarix®3种冻结前后HPV疫苗，流式细胞术分析结果显示不同的HPV疫苗具有不同的荧光颗粒峰。冻结后的HPV疫苗经柠檬酸／磷酸盐缓冲液解离后发现抗原降解为较小的颗粒，证实该方法可用于鉴别佐剂冻结对HPV疫苗质量的影响。Ye等［16］应用柯萨奇病毒A组16型（CA16）抗原实心（F）和空心（E）颗粒的单抗，建立了评价CA16颗粒热稳定性的ELISA方法。感染了CA16的细胞培养上清中含有成熟的F颗粒、E颗粒和变性颗粒。56℃加热1 min后F颗粒失去活性，变性颗粒和E颗粒含量上升，提示F颗粒可能转变为变性颗粒或E颗粒。

4 上市疫苗的稳定性研究

4.1 WHO对上市疫苗稳定性的分析报告 为了解疫苗的稳定性，WHO在2006年的指南文件中对近20种疫苗包括白喉／百日咳／破伤风疫苗（白百破疫苗）、乙肝疫苗、多糖和多糖结合疫苗、卡介苗、麻腮风疫苗、黄热病疫苗、OPV和IPV等，以及8种其它疫苗包括口服轮状病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、伤寒疫苗、霍乱疫苗、甲肝灭活疫苗、狂犬病毒疫苗、流感病毒疫苗和水痘疫苗等的热敏感性、冻结敏感性和不同温度下的稳定性进行了归纳总结。其中12种疫苗为冻结敏感性疫苗，包括破伤风／白喉疫苗（单价及联合疫苗）、乙肝疫苗、百日咳疫苗、IPV疫苗、肺炎多糖疫苗、肺炎结合疫苗、甲肝灭活疫苗、伤寒霍乱灭活疫苗冻结后可影响疫苗质量，流感和水痘减毒活疫苗可冷冻保存，但溶解后不能重新冻结［3］。2015年，WHO依据疫苗的热敏感性由高到低排列将疫苗分为6组，其中A组为OPV，B组为流感疫苗，C组包括IPV、冻干麻风或麻风二联或麻风腮三联疫苗；D组包括霍乱、百白破、麻疹、风疹、轮状、黄热等疫苗；E组包括BCG、HPV疫苗、破伤风等，F组包括乙肝疫苗、冻干流感嗜血杆菌疫苗（Hib）、流脑疫苗等［17］。

4.2 新研发上市疫苗的稳定性

4.2.1 HPV 疫苗：Shank-Retzlaff等［18］应用体外相对效力（IVRP）和示差扫描量热法（DSC）方法，评价默克公司Gardasil®疫苗的热稳定性。疫苗样本置于4℃到42℃，检测不同时间点的IVRP，结果表明Gardasil®具有较好的稳定性。疫苗在25℃时半衰期预计大于130个月；37℃时，半衰期为18个月；42℃时约为3个月。对3批疫苗在64℃条件下放置40 min后检测IVRP和ED50，结果显示热加速疫苗与4℃对照疫苗IVRP蛋白比值分别为：0.50～0.67，0.95～1.18；ED50分别为 0.52 ～0.77，0.10 ～0.13。显示热处理导致IVRP下降约50%，ED50升高4～7倍。应用DSC评价在温度快速升高条件下蛋白变性的过程，发现四种HPV单价成分的DSC特性不同，提示氨基酸结构细微的改变可显著影响与稳定L1蛋白有关的分子间的联系，并与VLP装配有关。该研究还认为，VLP疫苗相对较稳定，同时通过比较液相疫苗和佐剂疫苗热处理后的IVRP，认为该疫苗的铝佐剂有助于疫苗抗原保持稳定。

4.2.2 戊型肝炎（HE）疫苗：Zhang 等［19］应用小鼠体内效力和体外抗原方法评价12批2～8℃条件下储存24个月的预充注射器HE疫苗（Hecolin®）的稳定性；采用分析超速离心法、高效体积排阻色谱法和透射电子显微镜评估佐剂中解离的P239 VLP颗粒特性；应用DSC对吸附抗原的热及构象稳定性进行评估；应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染，液相色谱-质谱联用仪（LCMS）和MALDI-TOF方法考察解离抗原蛋白的完整性；应用表位表面等离子共振（SPR）检测法和基于单克隆抗体夹心ELISA法测定中和抗体结合活性和疫苗的抗原性。结果显示预充HE疫苗2～8℃储存24个月抗原结构和功能特性未发生改变，疫苗具有较好的稳定性。

4.2.3 口服轮状病毒疫苗：Naik等［20］对印度SIIPL公司研发的口服轮状病毒疫苗进行了稳定性评价。该疫苗为减毒活疫苗，含G1，G2，G3，G4和G5等5个血清型，以蔗糖-甘氨酸为保护剂。疫苗可在25℃条件下保存36个月，37℃和40℃条件下保存18个月，可短暂暴露于55℃条件下。并证实该疫苗在-20℃冷冻至42℃环境温度均耐受。该疫苗被认为是首个经实验室和临床试验验证的热稳定疫苗［21］。

5 小结

疫苗稳定性研究是保证疫苗安全有效的基础。我国疫苗产能居世界首位，疫苗质量达到国际水平，且近年来有多种新型疫苗成功上市，但关于疫苗稳定性研究的报道较少。迫切需要开展疫苗稳定性相关研究工作。在稳定性研究方案设计时，应依据研究目标的不同进行科学、周密的设计，选择适宜的监测方法和指标。在疫苗研发阶段，应充分考虑疫苗稳定性对其质量和应用的影响，包括疫苗的剂型和保护剂，以及疫苗接种可能面临的瓶颈。对已上市的疫苗制品，需考虑在保证冷链储运的前提下进行有效的稳定性监测，保证疫苗的安全有效。

利益冲突无