宁夏地区高血压肾损害患者肿瘤坏死因子-α-308基因多态性及其与贝那普利治疗反应的相关性研究*

于 欣，于美玲，张德凯，楚元奎，张怡清，白 静，邢译文，杨 震

(1.宁夏医科大学临床学院检验系，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004;3.宁夏医科大学总医院心脏中心，银川 750004)

高血压病是全球范围内的多发病和常见病。据报道2002年中国全民高血压发病率为18.8%[1]。近期的一项多中心研究显示，20岁以上的人群中，男性高血压发病率为30.09%，女性为24.79%[2]，总体呈现上升趋势。

除了心、脑、眼以外，肾脏也是高血压重要的靶器官之一。长期高血压能够导致肾功能不全、肾衰竭，是慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)的主要原因之一[3]。我国原发性高血压病患者约1亿人，其中10%～15%将进展至慢性肾衰竭，并最终依靠透析治疗维持生存，给个人、家庭和社会带来沉重的负担。鉴于高血压所致肾损害危害巨大，开展预测和早期防治具有非常重要的意义。

24 h尿蛋白排泄率可以作为识别高血压肾损害以及评估降压药物治疗反应的指标[4-5]，本课题组在前期研究中发现高血压肾损害患者的血清白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平高于单纯高血压组[6]，提示激活的炎性反应可能参与了高血压肾损害的发生、发展。高血压肾损害的发生有着一定的个体差异，而TNF-α与高血压肾损害相关，本研究检测了宁夏地区高血压病及高血压肾损害患者TNF-α水平及TNF-α-308基因多态性，以探讨TNF-α及其基因多态性与本地区高血压病及高血压肾损害的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年1月至2016年1月于宁夏医科大学总医院就诊的初诊为高血压病的患者284例，依据尿蛋白排泄率结果分为单纯高血压组(尿蛋白排泄率小于20 μg/min，n=152)和高血压肾损害组(尿蛋白排泄率大于或等于20 μg/min，n=132)，同时选取160例健康体检者作为正常对照组。高血压病的诊断标准为：收缩压大于或等于140 mm Hg,和/或舒张压大于或等于90 mm Hg,并排除继发性高血压。高血压肾损害的诊断：24 h尿蛋白排泄率大于或等于20 μg/min。对所有入选患者行尿蛋白排泄率检测以确定高血压肾损害者，同时排除禁忌证后在降压药物中选择贝那普利(10 mg，1次/d，服药时间为8:00-10:00)，若对贝那普利有禁忌证或咳嗽显著可用血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂代替，并根据患者情况在贝那普利基础上酌情联合其他降压药。16周后复查血浆TNF-α及尿蛋白排泄率，以此评价贝那普利的疗效。

1.2方法

1.2.1标本采集和储存 抽取患者清晨空腹静脉血于含枸椽酸钠抗凝剂(1∶9)的采血管中。4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取血浆分装于0.5 mL EP管中，-80 ℃低温冰箱中保存，以最后统一测定血浆各项指标。吸取白细胞层置于15 mL离心管中，加入红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置15 min。于4 ℃、3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，再将白细胞沉淀置于-20 ℃冰箱保存以行DNA提取。

1.2.224 h尿蛋白排泄率测定 入选患者留取2次(间隔1周以上)24 h尿标本(7:00至次日7:00)，测定总量后取5 mL，离心，取上清液置于-80 ℃冰箱冻存，最后统一用放射免疫法测定尿白蛋白，然后计算出24 h尿蛋白排泄率(μg/min)。

1.2.3实验试剂 放射免疫试剂盒(上海西唐生物技术公司)，酶联免疫检测仪(上海力康公司)，PCR试剂盒(上海西唐生物技术公司)，PCR仪(美国Applied Biosystems)。

1.2.4血浆TNF-α水平的测定 采用ELISA，具体方法按说明书(IL-6 ELISA试剂盒，美国RB公司)进行。

1.2.5TNF-α基因多态性检测

1.2.5.1模版DNA制备 在白细胞沉淀管中加入3 mL核裂解液[10.0 mmol/L Tris、0.4 mol/L NaCl、2.0 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)，pH 8.2]，充分混匀并悬浮白细胞，然后向每管中加入0.8 mL蛋白酶K溶液(2 mg/mL)与0.2 mL 10% SDS混合液，颠倒混匀，置于37 ℃过夜。次日晨取出离心管，如溶液澄清，加入饱和NaCl 1 mL，混匀15 s，3 000 r/min离心15 min。取含DNA的上清倒入另一离心管中，加入两倍体积(约8 mL)的无水乙醇，轻轻颠倒混匀至DNA析出并漂浮于液面，用无菌Tip头小心将DNA捞出，并移至EP管中，室温下待乙醇蒸发干净后加入TE(10.0 mmol/L Tris，pH 7.6，1.0 mmol/L Na2EDTA)50～150 μL，置于4 ℃保存，待DNA完全溶解后移至-20 ℃保存备用，同时取部分于紫外分光光度计下测定DNA水平。基因型测定采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性基因分析方法(PCR-RELP法)检测。

1.2.5.2引物设计 Forward:5′-AGGCA ATAGG TTTTG AGGGC CAT-3′；Reverse:5′-ACACT CCCCA TCCTC CCTGCT-3′。PCR扩增体系:预变性94 ℃ 3 min，94 ℃变性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，35次循环，完成后再于72 ℃延伸5 min。在 20 μL的酶切体系中，TNF-α-308位点的扩增产物5 μL用5 U msP1内切酶在 37 ℃酶切1.5 h。聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后，用1%溴化乙锭浸染30 min，使用凝胶成像及分析系统判断结果。

2 结 果

2.1一般资料结果 正常血压组、高血压组和高血压肾损害组之间年龄、性别构成、BMI、三酰甘油比较，差异无统计学意义(P>0.05)，高血压组和高血压肾损害组的收缩压、舒张压、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇高于正常血压组(P<0.05)。高血压组和高血压肾损害组的TNF-α水平较正常血压组高，且高血压肾损害组高于高血压组(P<0.05)，见表1。

表1 一般资料比较

a:P<0.05,与正常血压组比较；b:P<0.05,与高血压组比较

2.2TNF-α-308基因多态性分布 遗传平衡吻合度检验结果显示对照组、高血压组和高血压肾损害组TNF-α-308基因的多态位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在宁夏地区健康人群中，以AA基因型最为多见，其次依次为GA和GG，G/A等位基因频率分别为32%/68%；高血压组患者的TNF-α-308的基因型以GA为多见，其次为GG、AA，G/A等位基因频率分别为53%/47%；高血压肾损害患者的TNF-α-308的基因型以GG最为多见，其次为GA和AA，G/A等位基因频率分别为70%/30%。基因型及G/A等位基因频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示G等位基因频率与宁夏地区高血压肾损害相关，见表2。

表2 各组间TNF-α-308基因多态性比较[n(%)]

3组基因型比较，χ2=57.313，P<0.01；两组等位基因频率比较，χ2=80.206，P<0.01

2.3不同基因型间临床特征的比较 高血压肾损害患者的TNF-α-308的3种基因型GG、GA、AA中，GG基因型患者的低密度脂蛋白胆固醇和TNF-α水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示GG基因型与低密度脂蛋白胆固醇血症和TNF-α相关，见表3。

表3 高血压肾损害患者TNF-α-308的3种基因型的临床特征比较

2.4不同TNF-α-308基因型高血压肾损害患者对贝那普利治疗的反应 高血压肾损害组中TNF-α-308各基因型患者在β受体阻滞剂、利尿剂、钙拮抗剂的使用比例，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。对132例高血压肾损害患者予以贝那普利10 mg/d治疗16周后，AA基因型的治疗前后尿蛋白排泄率和TNF-α的改变幅度最大，其次是GA和GG基因型，3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，而三组间血压下降幅度差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表4 高血压肾损害组中TNF-α-308各基因型降压药物组成比较[n(%)]

表5 TNF-α-308不同基因型高血压肾损害患者贝那普利治疗反应比较

△收缩压/舒张压(mm Hg)=贝那普利治疗前收缩压/舒张压(mm Hg)-贝那普利治疗后收缩压/舒张压(mm Hg)；△尿蛋白排泄率(μg/min)=贝那普利治疗前尿蛋白排泄率(μg/min)-贝那普利治疗后尿蛋白排泄率(μg/min)；△TNF-α=贝那普利治疗前TNF-α(ng/mL)-贝那普利治疗后TNF-α(ng/mL)

3 讨 论

本研究结果发现，宁夏地区单纯高血压组和高血压肾损害组之间TNF-α-308的基因型有差异，高血压肾损害组的GG型频率高于单纯高血压组，提示高血压肾损害发生与炎症因子的基因多态性相关。

肾损害是高血压重要的靶器官损害，近年来研究发现高血压肾损害与免疫和炎症相关[7-8]，而TNF-α抑制剂及TNF-α中和治疗可减缓盐敏感型高血压肾损害的进展[9]，减轻肾脏的炎性反应和纤维化[10]。本课题组在前期研究中也发现高血压肾损害患者的血清TNF-α水平高于单纯高血压组[11]，提示激活的炎性反应可能参与了高血压肾损害的发生、发展。

高血压肾损害的发生具有个体差异性，受到多种因素的影响，除血压外，还受遗传异质性的影响。本研究结果提示，在遗传异质性当中，TNF-α-308的多态性也是其中的重要表现。本课题组在前期研究中发现高血压肾损害组的TNF-α水平升高[11]，提示TNF-α-308的基因多态性变化可能使得炎症因子的水平不同，从而出现不同程度的肾脏损害，这可能是TNF-α-308基因多态性与高血压肾损害相关性的机制所在。由于高血压肾损害的发生与TNF-α-308基因多态性相关，那么就可以通过检测患者的基因多态性来预测肾损害发生的可能性和风险性，在选择降压药物的时候，就可以优先选择对肾脏有保护作用的药物如血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体阻断剂类药物。

本研究还探讨了TNF-α-308基因型与高血压肾损害患者对贝那普利治疗的反应性之间的关联，结果发现TNF-α-308的AA基因型患者对贝那普利治疗的反应最佳，治疗前后尿蛋白排泄率和TNF-α的改变幅度最大，其次是GA和GG基因型，且这种作用独立于降压作用之外。说明高血压肾损害患者对贝那普利治疗的反应性与TNF-α-308的基因型有关，通过检测高血压肾损害患者的TNF-α-308的基因型可以预测患者对贝那普利的治疗效果，对于高血压肾损害患者选择合适的治疗药物具有更进一步的参考和指导价值。

综上所述，高血压肾损害及其对贝那普利治疗的反应与TNF-α-308基因的多态性相关，通过检测高血压患者的TNF-α-308基因多态性，可以预测高血压肾损害的发生，并可预测对贝那普利治疗的反应和效果，对临床治疗具有一定的参考价值。

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