脑钠肽在心脏性猝死与非心脏性猝死心肌组织中的表达

（中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110122）

心脏性猝死（sudden cardiac death，SCD）是指由于心脏原因引起的以突发性心脏停搏、意识骤然丧失为特征的，意外的、急速的自然死亡，占猝死发生率之首[1-2]。法医病理学鉴定心脏性猝死案例主要根据冠状动脉病变程度、心肌组织中有无出血、坏死及各器官的淤血程度等病理形态学改变。然而，在法医学实际鉴定工作中，相当一部分心脏性猝死案例缺乏典型的病理解剖及组织学改变，给法医学鉴定增加了难度。研究[3]表明，心脏功能性指标的检测对于缺乏典型病变的心脏性猝死的死亡机制分析有一定的实际意义。脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）在临床上被广泛用作心力衰竭的诊断指标，本实验拟观察不同死亡原因案例心肌组织中BNP的表达规律，以探讨BNP在心脏性猝死法医学鉴定中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

Jung RM2015石蜡切片机（德国Leica公司），7500实时荧光定量PCR仪（美国AB公司）。

兔抗人BNP多克隆抗体（AB125269，英国Abcam公司），山羊抗兔多克隆抗体（ZB-2301，北京中杉金桥生物技术有限公司），浓缩型DAB试剂盒（ZLI9018，北京中杉金桥生物技术有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（23227，美国Pierce公司），预染蛋白Marker（SM0671，立陶宛 Ferments公司），Western 印迹法增强化学发光剂（P0018，上海碧云天生物技术研究所），逆转录试剂盒（DRR037S）、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ RT-PCR PCR试剂盒（DRR081S，日本TaKaRa公司）、N-端脑利钠肽前体检测试剂盒（胶体金法，南京基蛋生物科技股份有限公司）。

1.2 实验材料及分组

96例均为中国医科大学法医鉴定中心2008年12月至2014年5月受理的案件。所有案例死亡至尸体检验时间，或小于48h，或于死后6h内冷冻保存择期尸体检验。经尸体解剖、组织病理学检验、毒（药）物检验及生物化学检验后作出法医病理学诊断。分别提取左、右心室壁心肌组织块，进行Western印迹法检测及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative realtime reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析。组织切片均来源于中国医科大学法医学院法医病理教研室病理学检查所用相应案例的左、右心室组织石蜡包埋块。心包液中氨基末端脑钠肽前体（N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide，NT-proBNP）检测结果由尸体检验结果提供（表1）。

表1 样本资料

心脏性猝死组（62例）：（1）急性心肌缺血21例，宏观及微观病理学检查未见心肌出血、梗死；（2）急性心肌梗死18例，心肌表面及切面可见新鲜片灶状出血、梗死，无陈旧性梗死灶；（3）再发性心肌梗死16例，肉眼可见陈旧性梗死灶；（4）病毒性心肌炎3例；（5）心肌病4例，包括肥厚性心肌病1例、扩张性心肌病1例、克山病1例、高钾性心律失常1例。

非心脏性猝死组（34例）：（1）肺动脉栓塞4例；（2）重度颅脑损伤 8例；（3）创伤、失血性休克7例，包括急性大失血2例、创伤性休克3例和高坠2例；（4）机械性窒息3例；（5）中毒5例，包括敌敌畏中毒1例、酮症酸中毒2例、甲基苯丙胺中毒2例；（6）其他7例，包括溺死3例、电击2例、低温下酒精中毒1例、烧伤休克1例。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学染色

制作5 μm厚切片，兔抗人BNP多克隆抗体以1∶500稀释，采用SP法进行免疫组织化学染色，苏木素复染细胞核。以PBS缓冲液代替兔抗人BNP多克隆抗体作为空白对照。

1.3.2 Western印迹法检测

心肌组织经液氮冷冻后研磨，加入组织-细胞裂解液，冰上匀浆，4℃下12000×g离心10min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳，110V 60min转印到PVDF膜上，经一抗（兔抗人BNP多克隆抗体，1∶400）、二抗（山羊抗兔多克隆抗体，1∶600）孵育后，采用Western印迹法增强化学发光剂发光。用Motic Images Advanced 3.2高级图像处理软件（麦克奥迪实业集团有限公司）对蛋白条带光密度进行半定量分析。各组均以GAPDH为内参。

1.3.3 RT-qPCR检测

Trizol法提取心肌组织中的总RNA，反转录为cDNA，PCR引物见表2。各组以GAPDH作为内参，用7500实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR检测，计算BNP mRNA的相对表达量（ΔΔCt法）。

表2 RT-qPCR引物序列

1.4 统计分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，Western印迹法和RT-qPCR实验结果使用±s表示；对心脏性猝死组与非心脏性猝死组的BNP平均光密度值及BNP mRNA相对表达量进行Kruskal-Wallis H检验；对年龄与BNP mRNA进行Pearson相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色结果

空白对照染色切片未见阳性染色（图1A）。

心脏性猝死组（图1B～D）中，左、右心室心肌组织中BNP免疫组织化学染色均呈现弥漫阳性表达。其中，急性心肌梗死案例可见心肌大片状坏死，心肌断裂处染色明显加深；再发性心肌梗死案例可见心肌间质纤维化，心肌断裂处染色明显加深；肥厚性心肌病案例可见心肌畸形肥大，间质纤维化。

非心脏性猝死组（图1E～H）中，重度颅脑损伤案例心肌未见明显异常，染色程度较浅；高坠案例可见心肌点片状染色，程度较浅；机械性窒息案例可见心肌片状坏死，染色弥漫，程度较浅，心肌断裂处染色明显加深；电击案例可见心肌断裂处及心肌边缘处染色阳性。

图1 部分案例心肌BNP免疫组织化学染色结果 SP×200

2.2 Western印迹法结果

Western印迹法结果（表3）显示，心脏性猝死组案例左、右心室心肌组织中BNP平均光密度值均高于非心脏性猝死组（P＜0.05），其中部分典型案例的Western印迹法结果见图2。

表3 Western印迹法检测各死因组案例心肌组织中BNP平均光密度值 （±s）

表3 Western印迹法检测各死因组案例心肌组织中BNP平均光密度值 （±s）

组别 例数/例 左心室壁 右心室壁心脏性猝死 62 0.134±0.087 0.108±0.049非心脏性猝死 34 0.062±0.034 0.067±0.025

图2 部分案例Western印迹法结果

2.3 RT-qPCR结果

RT-qPCR结果显示，心脏性猝死组中左心室壁心肌组织BNP mRNA的相对表达量高于非心脏性猝死组（P＜0.05，表 4）。

表4 心肌组织中BNP mRNA的相对表达量（±s）

表4 心肌组织中BNP mRNA的相对表达量（±s）

注：1）与心脏性猝死组比较，P＜0.05

组别 例数/例 左心室壁 右心室壁心脏性猝死 62 3.349±0.948 1.574±1.301非心脏性猝死 34 2.600±0.7701） 2.324±0.770

不考虑死亡原因，对所有案例心脏左心室壁、右心室壁BNP mRNA与心脏质量、双肺质量、NT-ProBNP均有正相关性（表5）。基于本实验的结果，尚不能证明BNP mRNA的表达与年龄相关（表5）。

表5 BNP mRNA与各因素的关系

3 讨 论

BNP是反映左心室舒张末压力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）的生化指标，与心力衰竭的严重程度有关。当心室容积扩张和心肌细胞受到牵张时，心室肌细胞合成及分泌大量的BNP[6-7]。BNP在临床上被广泛用作心力衰竭的诊断指标[8]。法医学相关研究[9-10]也表明，BNP可以反映死者生前的心功能状态，在不同死因案例中BNP呈现不同的表达趋势。NT-proBNP亦来源于脑钠肽前体（proBNP），因其生物活性较稳定，常被应用于法医学实际鉴定中。心肌组织是法医学鉴定中较易获取的检材，在法医学实际鉴定中可以通过组织学和分子生物学方法对心肌组织BNP进行定性和定量分析，从而判断生前的心功能状态，为缺乏典型病变的心脏性猝死案例的鉴定提供依据。然而，尚有部分案例的BNP表达情况及不同部位的心肌组织BNP的表达差异并不明确。

心脏性猝死组与非心脏性猝死组相比，心脏性猝死组中BNP免疫组织化学染色呈现弥漫阳性表达，Western印迹法结果也提示心脏性猝死组BNP蛋白表达较高，说明免疫组织化学染色及Western印迹法检测BNP的表达对心脏性猝死的法医学鉴定起到一定的辅助作用，但对具体死因的分类功能作用较小。

研究[11-13]表明，BNP浓度与年龄呈现正相关，但在本实验中，心肌组织BNP mRNA的表达与年龄无关，可能因本研究中选取案例较少所致。心肌组织中BNP mRNA的相对表达量与心脏质量、双肺质量及心包液中NT-proBNP浓度呈现正相关，这一结果提示心、肺质量与心功能的状态有一定的关系，法医病理学工作者在进行尸体解剖时应当注意器官质量，特别是心、肺质量的测量。

在心脏性猝死组中，左心室壁BNP mRNA的相对表达量较高，说明引起的心功能障碍以左心室功能障碍为主[14-15]。本课题组前期研究[16]表明，大鼠心律失常模型心肌组织中BNP的表达升高，提示急性心肌缺血患者的致死原因很可能与致死性心律失常有关。因此，BNP的检测对致死性心律失常这一猝死机制的分析有着重要价值。

综上所述，本研究在形态学、蛋白及mRNA水平讨论了心脏性猝死与非心脏性猝死案例人体心肌组织BNP的表达，同时将心肌组织BNP与心脏质量、双肺质量、心包液中NT-proBNP及年龄联系起来。BNP在心脏性猝死组中的高表达，可客观反映死者生前心功能状态，为死亡原因的判断及死亡机制的探讨提供一定的帮助。

[1]陈灏珠.实用内科学[M].12版.北京：人民卫生出版社，2005：1406-1411.

[2]赵子琴.法医病理学[M].4版.北京：人民卫生出版社，2009：411-432.

[3]ZHU B L，ISHIKAWA T，MICHIUE T， et al.Postmortem pericardial natriuretic peptides as markers of cardiac function in medico-legal autopsies[J].Int J Legal Med，2007，121（1）：28-35.

[4]曹志鹏，马慧，张圆，等.常用心脏标志物的生化检测及法医学应用[J].中国法医学杂志，2014，29（2）：124-127.

[5]朱宝利，石川隆紀，道上知美，等.法医解剖例における生化学的指標の死後変化[J].法医病理，2005，11：97-102.

[6]DANIELS L B，MAISEL A S.Natriuretic peptides[J].J Am Coll Cardiol，2007，50（25）：2357-2368.

[7]YASUE H，YOSHIMURA M，SUMIDA H，et al.Localization and mechanism of secretion of B-type natriuretic peptide in comparison with those of A-type natriuretic peptide in normal subjects and patients with heart failure[J].Circulation，1994，90（1）：195-203.

[8]MACGOWAN G A，NEELY D，PEASTON R，et al.Evaluation of NT-proBNP to predict outcomes in advanced heart failure[J].Int J Clin Pract，2010，64（7）：892-899.

[9]CHEN J H， MICHIUE T， ISHIKAWA T， et al.Pathophysiology of sudden cardiac death as demonstrated by molecular pathology of natriuretic peptides in the myocardium[J].Forensic Sci Int，2012，223（1-3）：342-348.

[10]CHEN J H， MICHIUE T， ISHIKAWA T， et al.Molecular pathology of natriuretic peptides in the myocardium with special regard to fatal intoxication，hypothermia， and hyperthermia[J].Int J Legal Med，2012，126（5）：747-756.

[11]WAKU S， IIDA N， ISHIHARA T.Significance of brain natriuretic peptide measurement as a diagnostic indicator of cardiac function[J].MethodsInf Med，2000，39（3）：249-253.

[12]OHASHI M，FUJIO N，NAWATA H，et al.High plasma concentrations of human atrialnatriuretic polypeptide in aged men[J].J Clin Endocrinol Metab，1987，64（1）：81-85.

[13]RAIZADA V，THAKORE K，LUO W，et al.Cardiac chamber-specific alterations of ANP and BNP expression with advancing age and with systemic hypertension[J].Mol Cell Biochem，2001，216（1-2）：137-140.

[14]STOUPAKIS G， KLAPHOLZ M.Natriuretic peptides：biochemistry， physiology， and therapeutic role in heart failure[J].Heart Dis，2003，5（3）：215-223.

[15]CHARLES C J，ESPINER E A，NICHOLLS M G， et al.Clearance receptors and endopeptidase 24.11：equal role in natriuretic peptide metabolism in conscious sheep[J].Am J Physiol，1996，271（2 Pt 2）：R373-R380.

[16]CAO Z P，ZHANG Y，MI L， et al.The expression of B-type natriuretic peptide after CaCl2-induced arrhythmias in rats[J].Am J Forensic Med Pathol，2016，37（3）：133-140.