木霉菌发酵培养基响应面优化

丁志雯+胡永红+杨文革

摘要：为了优化木霉菌YHWG5102发酵培养基，以对水稻纹枯病的抑菌圈直径大小为优化的指标，在单因素试验的基础上进行Plackett-Burman试验和中心组合试验设计，采用响应面法建立发酵培养基的优化模型。结果表明，得到最优培养基配方：23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米浆、0.81 g/L K2HPO4。经试验验证，在此培养基条件下，木霉菌YHWG5102抑菌圈直径达27.19 mm，比优化前提高约42%。

关键词：木霉菌；发酵培养基；最优培养基配方；水稻纹枯病；响应面法

中图分类号： S188+.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0275-04

1材料与方法

1.1菌种

木霉菌YHWG5102、水稻纹枯病病菌，均由笔者所在课题组保藏。

1.2培养基

活化培养基：200 g/L马铃薯，20 g/L蔗糖，15～20 g/L琼脂，pH值自然。

种子培养基：20 g/L蔗糖，11.16 g/L酵母浸粉，0.5 g/L K2HPO4，1 g/L MgSO4，pH值6.5。

发酵培养基：20 g/L蔗糖，11.16 g/L酵母浸粉，0.5 g/L K2HPO4，1 g/L MgSO4，pH值6.5。

1.3主要试剂与仪器

琼脂粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、肌醇、蛋白胨、酵母浸粉、尿素，购自国药集团化学试剂有限公司；（NH4）2SO4、NaCl、CaCl2、FeSO4、MgSO4、K2HPO4，购自广东省汕头市西陇化工厂；工业用玉米浆与马铃薯，市售。

电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；灭菌锅，广州市华粤行仪器有限公司；医用净化工作台，苏州净化设备有限公司；鼓风电热恒温干燥箱，上海试验仪器厂有限公司；真空抽滤机，河南省予华仪器有限公司；电子天平，瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司；基础分析型纯水机，青岛富勒姆科技有限公司。

1.4试验方法

1.4.1菌种培养（1）平板活化：从甘油管中将菌种接到活化培养基上，26 ℃恒温培养，培养6～7 d；（2）种子液培养：在500 mL锥形瓶中装100 mL种子培养基，从平板上挑取菌落接种于摇瓶中，培养温度26 ℃，摇床转速120 r/min，培养3 d后进行接种发酵；（3）摇瓶发酵培养：在500 mL锥形瓶中装100 mL发酵培养基，向培养基中接种2 mL种子液，培养温度26 ℃，摇床转速120 r/min。

1.4.2木霉菌抑菌圈直径的测定采用牛津杯法进行抑菌试验，将发酵液经抽滤、微滤（0.45 μm）后取滤液，对水稻纹枯病进行抑菌试验，根据抑菌圈直径确定抑菌能力。

1.4.3单因素试验设计分别对不同种类的碳源、氮源、无机盐进行优化，配制发酵培养基，26 ℃发酵培养4.5 d，测定每种因素对抑菌圈直径的影响，选择最佳培养基成分。

1.4.4响应面试验设计（1）Plackett-Burman（PB）设计试验：利用Plackett-Burman试验从多个单因素中筛选出对抑菌直径影响最显著的几个因素，使用Design Expert软件设计试验方案，包括11个变量（n=11），其中9个为主要变量（葡萄糖含量、麦芽糖含量、蔗糖含量、蛋白胨含量、玉米浆含量、酵母浸粉含量、K2HPO4含量、MgSO4含量、FeSO4含量），2个为虚拟变量，分别用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K代表以上变量，每个变量有高（+）、低（-）2個水平（表1）。

（2）最陡爬坡试验：最陡爬坡试验在PB试验中得到影响较为显著的3类因素，并且根据PB设计得出的一次项拟合方程中相应变量的系数，从而确定变化梯度、爬坡方向。若变量系数为负，则该变量水平以梯度递减的方向进行爬坡试验。

（3）响应面法分析：经过最陡爬坡试验，逼近抑菌圈直径最大化区域，根据Box-Bellnken原理，对经过PB和爬坡试验的变量进行5水平试验（-1.68、-1、0、+1、-1.68），共20组试验，使用Design-Expert软件对试验结果进行分析，研究木霉菌YHWG5102次级代谢产物中抑菌物质量含量最高的发酵培养基配方。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1不同种类的碳源对抑菌圈大小的影响碳源是构成菌体的基本骨架，是菌体生长的能量来源，通过影响菌体的呼吸、能量供给、生长及相关代谢最终影响抗生素等次级代谢产物的产量[7]。由图1可知，在选择的5种碳源中，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对木霉菌抑菌效果的影响较为明显，其中葡萄糖效果最好。因此，在下个阶段的PB设计中，将葡萄糖、蔗糖及麦芽糖作为考察因素。

2.1.2不同种类的氮源对抑菌圈大小的影响氮源在合成菌体各种初级、次级代谢产物等含氮物质的过程中发挥着重要作用，同时在发酵生产中氮源起着调节菌体的生长及生物量的作用[8]。以上一步试验得出的最优碳源葡萄糖作为本步试验的初始碳源。由图2可知，木霉菌不仅可以利用有机氮源，也可利用无机氮源，玉米浆、蛋白胨和（NH4）2SO4对抑菌圈直径影响较大，其中玉米浆效果最佳。

2.1.3不同种类的无机盐对抑菌圈大小的影响无机盐是微生物生命活动中必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶的活性中心的组成部分、维持细胞结构的稳定性等。以上述试验得出的最优碳源葡萄糖及最优氮源玉米浆作为本步试验的初始碳源与氮源。由图3可知，K2HPO4对抑菌圈直径影响最为明显，这可能由于钾是合成次级代谢产物中具有抑菌活性物质的关键元素，MgSO4、FeSO4的抑菌圈直径次之。

2.2响应面设计

2.2.1Plackett-Burman设计试验通过单因素试验表明，在木霉菌抑菌试验中，对其影响较大的9个变量为葡萄糖含量、蔗糖含量、麦芽糖含量、玉米浆含量、蛋白胨含量、（NH4）2SO4含量、K2HPO4含量、MgSO4含量和FeSO4含量，再加上2个虚拟变量，每个变量有高（+）、低（-）2个水平，采用Design-Expert软件设计试验，共计12组试验（表2）。使用Design-Expert对表2进行分析，得到Plackett-Burman设计方差分析结果。由表3可知，上述9个因素对抑菌圈大小的影响程度排序为葡萄糖含量>蔗糖含量>麦芽糖含量>玉米浆含量>K2HPO4含量>MgSO4含量>FeSO4含量>蛋白胨含量>酵母浸粉含量，其中葡萄糖含量为显著因素。该模型R2=0.999 7，表示99.97%的试验数据可用该模型来解释；从9个因素中选出对抑菌圈直径影响显著（P<0.05）的3类因素（葡萄糖含量、玉米浆含量、K2HPO4含量）进行下一步优化。endprint

2.2.2最陡爬坡试验根据PB试验结果，葡萄糖含量、玉米浆含量、K2HPO4含量的模型方程系数为正值，进行正爬坡。由表4可知，第4组试验方案对应的抑菌圈直径达到最大值，以此值为中心进行响应面试验，这样响应面方程才能充分逼近真实值。

2.2.3响应面法分析经过Plackett-Burman试验和爬坡试验，确定葡萄糖含量、玉米浆含量、K2HPO4含量的水平（表5），利用Design-Expert软件设计响应面试验，结果见表6。

3结论与展望

在单因素试验的基础上，经Plackett-Burman试验确定了葡萄糖、玉米浆和K2HPO4为主要影响因素，在此基础上，进行最陡爬坡试验，确定最佳响应面区域，然后采用中心组合试验设计和Design Expert软件分析计算，得到这3种因素的最佳添加量：23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米浆、0.81 g/L K2HPO4。在此发酵培养基下重复进行3次验证试验，结果表明，木霉菌YHWG5102对水稻纹枯病的抑菌圈直径实测平均值为27.19 mm，与未优化的培养基初始抑菌圈直径（约为19.1 mm）相比增加约42%。

然而此研究仅限于摇瓶发酵， 很多因素（如溶氧、通气量表7回归方程方差分析结果

等）难以有效控制，下一步可以上罐分批发酵，进一步优化木霉菌的培养条件，尽可能提高木霉菌次级代谢产物中具有抑菌作用的物質含量，然后通过硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步确定具有抑菌作用的物质[9-10]，以期得到更稳定、高效的新型木霉菌制剂。

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