制备型高效液相色谱法分离纯化绿原酸

王彩杰

摘要：绿原酸是植物在有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，是金银花、杜仲、淡竹叶等中草药的主要有效成分之一。高效液相色谱是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。文章主要运用高效液相色谱法来对杜仲叶中的绿原酸进行分离纯化。

关键词：杜仲叶；绿原酸；FLEXA系列制备液相色谱仪；分离纯化

杜仲是我国特有的木本植物，是一种名贵的中药材。传统上以杜仲皮入药，但近年来的研究结果表明，杜仲叶和皮成分基本相同，特别是杜仲叶中绿原酸和黄酮的含量远高于皮中的含量。绿原酸（Chlorogenic acid）是植物在有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，具有利胆、抗菌、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药用功能。绿原酸在植物界广泛存在，但含量较高的植物不多。近年来的研究表明，杜仲叶中绿原酸含量较为丰富，达3.6%～5.5%。因此分离纯化杜仲叶中的绿原酸十分必要。

1杜仲叶的药理特性概述

杜仲为杜仲科杜仲属植物，《中国药典》记载其有补肝肾、强筋骨、安胎等功效，用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕口眩、妊娠漏血、胎动不安川。我国杜仲资源丰富，研究利用历史悠久，传统上杜仲主要以皮入药，树龄需达到一定年限方可剥皮，然而杜仲树干剥皮后需间隔3-4年后方可再次剥皮，而且剥皮后杜仲树若养护措施不足，极易造成皮剥树死，从而对杜仲资源造成极大浪费，严重影响杜仲资源的可持续发展。杜仲叶为每年夏秋两季杜仲树枝繁叶茂时采摘，经干燥后所得。研究表明，杜仲叶与杜仲树皮活性成分基本一致，药理作用基本相同。相较于杜仲皮，杜仲叶具有来源丰富、再生循环能力强、合理采摘对杜仲资源不会造成破坏等特点。研究表明，杜仲叶所含的有效活性成分主要包括黄酮类、绿原酸、环烯醚砧类、多糖类、多酚类、苯丙索类、木脂索类等化合物。药理研究结果表明，杜仲叶具有降血压、调节血脂、防治骨质疏松、降血糖、镇静安神、抗疲劳等作用，在食品、医药行业具有广泛的应用价值。

2杜仲叶中所含绿原酸的研究现状

绿原酸属于苯丙索类化合物，广泛存在于金银花、牛薯叶、向日葵、雪莲果、蒲公英等植物中，杜仲叶中也含有丰富的绿原酸，含量一般可达1%-5%，为杜仲叶主要有效成分之一。绿原酸具有较好的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等生理功能，因而在保健食品和医药行业具有很广泛的应用。我国杜仲叶分布广泛，产量巨大，且多为野生，是非常好的绿原酸原料来源，以杜仲叶为原料制备绿原酸具有得天独厚的优势。李旭等对微波辅助提取杜仲叶中绿原酸的工艺进行了研究，响应面优化提取工艺结果表明，杜仲叶粉碎至80目，以30%乙醇为提取溶剂，料液比为1：26（g：mL），微波功率为722W时，提取2.5min，绿原酸提取量可达29.74mau/g。与醇提相比，水提则相对方法简单，经济节约，叶宏等以水为溶剂提取杜仲叶中的绿原酸，提取率可达95%。杜仲叶在我国分布广泛，杜仲叶中绿原酸地域差异明显。除地域差异外，采收期、杜仲树龄、干燥方法以及储存时间均对杜仲叶中绿原酸含量有较大影响。

3杜仲叶中绿原酸的分离纯化实验

3.1儀器与试剂

实验仪器为：FLEXA系列制备液相色谱仪（自组）、200-400nm双波长检测器、ATS-051-H25高压自动进样器和7725I分析型手动六通进样阀等。对照品为中国药品生物制品检定所提供的绿原酸。样品来源于本实验室从杜仲叶中提取纯化而得的绿原酸晶体。实验试剂为：甲醇，分析纯，有机酸A，B，C和D，分析纯；有机酸E，分析纯（试剂配制后用0.45μm微孔滤膜过滤）；绿原酸标准样品；绿原酸粗品（由杜仲叶水提醇沉，再经大孔吸附树脂纯化后得到）；水（为二次蒸馏水）。

3.2色谱条件

ODS色谱柱（国产不锈钢柱，直径×长80mm×500mm，C18粒径为20～40μm）；流动相为醇B-水-酸（体积比为15∶85∶0.1）；流速梯度洗脱；检测波长为254nm；进样量为10mL。色谱条件为[13]：YWG-C18色谱柱（直径×长为6mm×150mm，C18粒径为5μm）；流动相为乙腈-水-乙酸（体积比为10∶88∶2）；流速为1 mL/min；柱温为25℃；衰减为3；纸速为3mm/min；测定波长为326nm；进样体积为6μL。

3.3绿原酸标准溶液的配制

精密称取绿原酸对照品适量，用流动相溶液溶解并稀释到1 000μg/ml，得标准储备溶液（宜储存于棕色容量瓶中）。精密量取储备液适量，用流动相配成含绿原酸分别为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的标准溶液，依次进样20μl进行测定。

3.4绿原酸样品的制备及测定

3.4.1样品的制备

将阴干的杜仲叶放入提取罐中，加入适量的去离子水，在室温下采用超声波预处理后，用SZTC天然沉降剂代替醇沉工艺，以除去蛋白质、鞣质、树脂、果酸等大分子物质；然后再利用超滤膜分离技术处理提取液（这时固溶物绿原酸含量可达10%左右）；最后采用有机溶剂分离纯化，减压回收溶剂，干燥后得样品。

3.4.2样品绿原酸的测定

精确称量样品10mg左右，加流动相溶液溶解，定容到50ml，用超声波脱气，过滤后进样20μl，测定样品的峰面积，根据上述回归方程对样品进行含量测定。

3.5回收率试验

取5份样品，分别加入一定量的标准溶液，然后进行测定，其结果为平均回收率98.45%，CV-1.37%。精密度试验：将样品分别进样5次，其峰面积分别为：263 348、262 533、263 255、263 389、264 123。

4结 论

4.1测定结果

根据上述方法测定，本室分离提纯的杜仲绿原酸含量达74.74%。

4.2提取溶剂的选择

对杜仲叶中提取绿原酸的溶剂研究表明，用70%以上的醇提取，虽然绿原酸的得率和含量都较高，但总提物较多、色重，且乙醇损耗大，给后续的分离纯化带来困难；用水提取，绿原酸得率虽然较低，但提出物较少，绿原酸含量仍然较高，且经济实惠，所以采用水溶剂。但是，在试验中发现，如果水的硬度太大，提取效果也不是很好，最终我们选用去离子水为提取溶剂。

4.3超声波提取法

该法具有节能、节时、提取率高等优点，其原理是：超声波发生器在提取罐体内共振产生大量高压微气穴，附着在提取物表面，瞬时破裂时，几千大气压瞬时击破细胞壁，使植物细胞破裂，从而加快和提高杜仲绿原酸等有效成分的溶出。

4.4控制pH值

水提时要注意控制好溶液的pH值，使之呈弱酸性并且要防止高温。这是因为绿原酸具有邻苯二酚及羧基结构，常以盐的形式存在于植物体中，且它的稳定性及存在状态与溶液的pH值有关。另外在高温条件下，绿原酸容易分解、氧化。

综述所述，杜仲作为我国特有的树种，分布广泛，相较于杜仲树皮，杜仲叶属于可再生资源，产量巨大，加紧对杜仲叶的研究和开发应用必将产生巨大的经济效益和社会效益。绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、增高白血球及兴奋中枢神经系统、抗氧化、抑制高血压等功效。文章采用反相高效液相制备系统，以乙醇-水和少量羧酸为流动相，制备了CGA，并结合高效液相色谱分析法，可得到纯度为74.74%的CGA产品。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015

[2]赖玲林，肖苑，彭小芳，冷恩念，莫镇涛，李文娜，陈阳，李意奇.杜仲叶绿原酸提取物联合西红花苷对肝癌细胞胆固醇代谢的影响[J].山东医药，2017，57（08）

[3]唐芳瑞，刘荣华，邵峰，李于益，张忠立，黄慧莲.不同产地杜仲叶高效液相色谱指纹图谱分析[J].时珍国医国药，2016，27（06）