中枢乳酸干预在运动疲劳介导苍白球神经元电活动变化中的作用

侯莉娟+时凯旋+徐萌+刘晓莉+乔德才

摘 要：通过人工干预脑内乳酸浓度，观察能量代谢对大鼠苍白球内侧部（globus pallidus internal segment，GPi）神经元电活动的影响，从脑能量代谢角度揭示GPi神经元在运动性中枢疲劳中的可能作用机制。方法：Wistar大鼠随机分为安静对照组（CG）、乳酸干预组（10 mmol/L组、100 mmol/L组）。采用玻璃微电极记录到GPi神经元稳定电信号后，于侧脑室微量注射乳酸阻断剂（alpha-cyano-4-hydroxycinnamate，4-CIN），观察记录到神经元电活动变化情况，对其进行统计分析。结果：与CG组相比，4-CIN1和4-CIN2组神经元放电频率均明显降低（P<0.01），4-CIN2组神经元放电频率较4-CIN1组明显降低（P<0.05）；与CG组相比，4-CIN1规则放电比例显著降低（P<0.05），不规则放电和爆发式放电比例显著升高（P<0.05），4-CIN2组规则放电数目较4-CIN1组显著降低（P<0.01），不规则放电和爆发式放电均显著升高（P<0.01）。结论：4-CIN影响神经元与星形胶质细胞之间的乳酸转运过程引起GPi内乳酸转运障碍，抑制GPi神经元放电活动，且抑制作用存在剂量依赖；由此推测，阻断神经元对乳酸的摄取与利用可能是导致神经元电活动变化的原因之一。

关键词：脑乳酸；苍白球内侧部；脑能量代谢；神经元电活动

中图分类号：G 804.2 学科代码：040302 文献标识码：A

Abstract： Objective： Based on brain energy metabolism， we investigated effects of lactate intervention on spontaneous firing of GPi in rats to reveal the possible mechanism of neuronal electrical activity in exercise-induced fatigue. Methods： Male Wistar rats were randomly divided into control group （CG）， lactate intervention group （4-CIN） respectively for 10 mmol/L group and 100 mmol/L group.We used the extracellular glass microelectrode technique to record the stable neural firing signal， then observe effect of intracerebroventricular injections of brain lactate blockers （4-CIN） on neural firing. Results： Compared with the control group， the neural firing rates in 4-CIN1 and 4-CIN2 significantly reduced and 4-CIN2 was lower than 4-CIN1 （P<0.01）. The percentage of regular firing pattern neurons in 4-CIN1 reduced compared with control group （P<0.05）， while the irregular firing pattern and burst neurons increased （P<0.05）； the percentage of regular firing pattern neurons in 4-CIN2 were markedly lower than 4-CIN1 （P<0.01）， while the irregular firing pattern and burst neurons were observably higher （P<0.01）. Conclusion： The dysfunction of lactate transport caused by the blocking of lactate conduction between neurons and astrocytes could inhibit the spontaneous firing of GPi's neurons， and the inhibition effects depended on the dose of 4-CIN. It is supposed that one of the possible mechanism of changes in neural firing activity was the block of lactate uptake and utilization in neurons.

Keywords： brain lactate； globus pallidus internal segment； brain energy metabolism； neuronal electrical activity

運动疲劳的产生由中枢和外周系统共同介导。当前研究认为运动疲劳产生的重要机制之一是神经冲动不能持续有效到达所支配的肌肉，该过程的生理基础是中枢能量代谢的失衡。乳酸一直以来被认为是代谢产物或中枢神经系统缺氧的标志[1]，乳酸穿梭假说（astrocyte-to-neuron lactate shuttle， ANLSH）提出，当神经元内葡萄糖和乳酸共同存在时，神经元能够优先利用乳酸供能[2-3]。研究表明，大鼠和人脑内存在胞外“乳酸池”[4]，能够为脑内神经元功能活动提供源源不断的能量[5]。本实验室的前期研究发现，微量注射脑乳酸阻断剂，大鼠皮层脑电功率下降、运动能力下降[6]，同时对大鼠脑内乳酸水平动态监测发现，脑乳酸水平在力竭运动后期、力竭即刻及恢复期都发生显著降低[7]。表明运动疲劳的产生与乳酸代谢介导的脑区神经电活动密切相关。endprint

苍白球内侧部（globus pallidus internal segment，GPi）是“皮层—基底神经节—丘脑—皮层”运动控制环路中的重要环节[8]，运动疲劳的出现主要是由于GPi神经元兴奋对皮层神经元产生去兴奋作用[9]。这种神经元电活动的改变是否与脑内乳酸浓度的降低或乳酸转运障碍有关，目前还缺乏实验证据；因此，本研究从脑能量代谢和神经电生理角度，通过脑乳酸阻断剂4-CIN干预脑内乳酸浓度，试图解释脑乳酸浓度的改变对大鼠基底神经节输出核团之一GPi神经元电活动的影响，为运动疲劳的脑能量代谢和神经元电活动的可能机制研究提供理论依据。

1 实验对象与仪器设备

1.1 实验对象

选用8周龄健康雄性Wistar大鼠，体重（280±10） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（生产许可证号：SCXK京2012-0001）。大鼠在实验室适应性饲养3 d（分笼饲养），自由饮水进食（术前进食除外），24 h昼夜循环光照，室温保持在（22±2） ℃。随机分为对照组（CG）、乳酸干预组（alpha-cyano-4-hydroxycinnamate，4-CIN），包括10 mmol/L组（4-CIN1）、100 mmol/L组（4-CIN2），每组7只，共计21只。

1.2 实验仪器与试剂

SN-3N脑立体定位仪、SM-21微量推进器、POWERLAB电生理记录分析系统、P-21玻璃微电极拉制仪、AXONPATCH-1D电生理信号放大器、MF-5362颅骨钻、Millipore014超纯水过滤系统；人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF）各组（浓度）分别为Nacl（124 mM）、KCl（3 mM）、NaHCO3（26 mM）、NaH2PO4·2H2O（26 mM）、MgSO4·7H2O（2.0 mM）、CaCl2（2.0 mM）及C6H12O6·H2O（10 mM），pH为7.4，用0.2 uM无菌过滤器过滤，冷藏备用。

2 研究方法

2.1 大鼠侧脑室微量注射套管植入手术

适应性饲养后，10%水合氯醛麻醉，暴露颅骨并固定在脑立体定位仪上（日本成茂），前后囟处于同一水平面。根据Paxinos & Watson大鼠脑立体定位图谱，以50 μm/s的速度将微量注射套管植入侧脑室（AP：0.9 mm ，L：1.5 mm，H：3.5 mm）；牙科水泥固定注射套管以备侧脑室给药，注射地塞米松注射液以缓解术后脑水肿。术后恢复4～5 d，待其能够正常行动与饮食。

2.2 胞外电信号采集

10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定在脑立体定位仪上，术中施加2%盐酸普鲁卡因局部麻醉。电极插入GPi（AP：-2.8 mm，L：2.9 mm，H：7.6 mm）。当稳定记录到神经元电信号后，微量推进器向侧脑室内注射脑乳酸阻断剂，注射速度为0.5 μL/min，持续注射10 min；CG组大鼠施以相同剂量的人工脑脊液，分别记录GPi神经元电活动。玻璃微电极尖端直径3～5 μm，阻抗3～8 MΩ，内灌 3 mol/L NaCl 溶液。记录信号经 AXONPATCH-1D放大器，输入PowerLab信号处理系统。

2.3 组织学定位

对信噪比满足3∶1和放电稳定的神经元进行记录；信号采集结束后，记录电极冲灌滂胺天蓝，电泳标记电极尖端位置，电泳时间10 min。常规灌流、固定、切片，使用光学显微镜鉴定记录电极尖端所在位置。

2.4 数据处理

使用Lab Chart8.0进行线下分析，包括神经元放电形式、神经元放电数目、神经元放电形式百分比、神经元放电频率、平均峰峰间隔直方图（interspike interval histogram，ISIH）等，结果均以平均数±标准差表示，组间神经元放电频率和放电形式分析采用One-Way ANOVA分析，百分比数据的比较用卡方检验，P<0.05表示差异具有显著性，P<0.01表示差异具有非常显著性。

3 结果

3.1 GPi神经元放电特征

GPi神经元放电形式主要分为规则放电、不规则放电和爆发式放电3种形式，原始记录如图2A所示；采用ISIH对神经元的放电形式筛选[10]，规则放电的ISIH表现呈对称性分布，不规则放电的ISIH呈随机分布，爆发式放电的ISIH则呈正偏态分布，且表现出明显的衰减趋势[11]，如图2B所示；从自相关图可见，规则放电自相关图无偏态峰出现，比较均匀；不规则放电自相关图中出现偏态“峰”，但与爆发式放电偏态“峰”相比，“峰”的震荡性较小；爆发式放电自相关图呈现震荡性很强的峰，且单位时间内统计到的锋电位个数主要集中在中心小于15 ms的位置，如图2C所示。

3.2 微量注射4-CIN对GPi神经元电活动的影响

3.2.1 微量注射4-CIN对GPi神经元放电频率的影响

CG组、4-CIN1组和4-CIN2组各记录到神经元放电个数分别为61、60、58个，微量注射不同浓度4-CIN对大鼠GPi神经元电活动产生明显影响。干预组神经元放电频率较CG组（18.53±1.35） Hz明显降低（P<0.01），4-CIN2组神经元放电频率（4.10±0.74） Hz较4-CIN1组（9.21±1.48） Hz明显降低（P<0.05），说明微量注射4-CIN阻断神经元对乳酸的摄取和利用，导致神经元放电频率降低，并且较高浓度的4-CIN比较低浓度的抑制作用更明显，如图3和图4所示。

3.2.2 微量注射4-CIN对GPi神经元放电特征的影响

本实验进一步对神经元放电特征进行分析，与CG组相比，4-CIN1组大鼠神经元放电形式中规则放电数目显著降低（P<0.05），不規则放电和爆发式放电均显著升高（P<0.05）；在神经元放电形式百分比中，规则放电比例显著降低，不规则放电和爆发式放电比例显著升高；4-CIN2组大鼠神经元放电形式中规则放电数目较CG组显著降低（P<0.01），不规则放电和爆发式放电均显著升高（P<0.01）；在神经元放电形式百分比中，规则放电比例显著降低，不规则放电和爆发式放电比例显著升高；对4-CIN1组和4-CIN2组神经元放电数目比较发现，4-CIN2组神经元规则放电数目显著降低（P<0.01），不规则放电和爆发式放电数目显著升高（P<0.01）；2组神经元放电形式百分比比较发现，4-CIN2组规则放电比例显著降低，不规则放电和爆发式放电比例显著升高，如图5A和5B所示；众数是指最高频率对应的峰峰间隔，反映峰峰间隔的集中程度，组间比较发现，4-CIN1组众数较CG组显著升高（P<0.01），4-CIN2组众数较CG组和4-CIN1组均显著升高（P<0.01），如图5C所示；在反映放电间隔集中程度的平均峰峰间隔上组间比较发现，4-CIN1组平均峰峰间隔较CG组显著升高（P<0.01），4-CIN2组平均峰峰间隔较CG组和4-CIN1组均显著明显升高（P<0.01），如图5D所示。endprint

4 分析与讨论

4.1 GPi在基底神经节信息整合中的作用

大脑皮层—基底神经节环路是脑内运动控制的主要环路。大脑皮层是随意运动控制的最高级中枢，基底神经节是由皮层下的一些核团构成，主要包括纹状体、苍白球外侧部（globus pallidus external segment，GPe）、丘脑底核（subthalamic nucleus，STN）、GPi、黑质网状部（substantia nigra reticulata，SNr）5个核团。基底神经节接受来自皮层的传入信号经整合后反馈给大脑皮层，参与运动控制、运动学习、功能和行为的执行和情感等生理过程。纹状体是皮层向基底神经节信息输入的主要核团，分别通过直接通路（纹状体—GPi/SNr—丘脑—皮质）和间接通路（纹状体—GPe —STN—GPi/SNr—丘脑—皮质）实现对运动的精细编码。GPi/SNr是基底神经节主要的信息输出核团，通过直接通路和间接通路将基底神经节的信息传入丘脑，其功能活性影响皮层的运动指令发放[12]。GPi主要接受来自上游核团纹状体和GPe的GABA抑制性投射（纹状体约占70%，GPe约占15%），以及STN的谷氨酸（glutamate，Glu）能兴奋性投射（约占10%）。由于信息在这3种投射纤维的传导速率、释放神经递质及激活受体类型不同，信息到达GPi/SNr复合体后经过抑制性的GABA能纤维投射至丘脑，再经过兴奋性Glu能纤维传导至皮层，使大脑皮层神经元出现一个“抑制—增强—抑制”的动态变化过程[9]。

本实验室前期研究发现，大鼠GPi参与了基底神经节对运动疲劳的调控，表现在GPi神经元在运动疲劳状态下兴奋性增加，GPi/SNr的过度兴奋，抑制运动皮层活动[13]。GPi不仅参与运动疲劳下运动衰减过程，还是许多运动障碍性疾病的病理基础之一。在帕金森病中，黑质DA能神经元渐进性退变，引起直接通路的易化和间接通路的过度激活，导致GPi/SNr神经元兴奋性增加，投射到丘脑后使皮层神经元兴奋性降低，导致运动不能；另一重要病理表现为苍白球神经元放电的峰峰间隔序列及放电模式趋于一致和同步化，苍白球毁损术可降低GPi兴奋性并减轻PD运动障碍[14]。基于前人和本实验室的研究推测，GPi对直接和间接通路信息具有重要整合功能，其功能活性的改变可能是运动疲劳及运动障碍出现的重要原因。

4.2 脑乳酸对神经元功能的维持和保护作用

脑内Glu通过星形胶质细胞摄取后，刺激发生糖酵解过程，产生的乳酸被神经元摄取和利用，维持其能量代谢。脑内乳酸的代谢过程离不开单羧酸转运体（monocarboxylate transporters， MCTs），MCTs不同亚型可控制星形胶质细胞和神经元之间的乳酸流动。乳酸穿梭发生时，胞外的Glu释放增多，一个Glu可携带3个Na+，Na+浓度梯度被破坏，触发Na+-K+-ATP酶打开电压门控通道引起Na+内流，星形胶质细胞内Na+浓度升高；Glu和Na+可激活谷氨酰胺合成酶和钠泵，增加ATP的消耗，加速对葡萄糖摄取和酵解酶，星形胶质细胞进一步生成乳酸及ATP。该过程中，离子通道的开放抑制了K+外流或促进Na+内流，造成细胞膜去极化产生动作电位，激活神经元摄取乳酸。Gpe内乳酸穿梭过程主要依靠MCT2和NMDA受体调节，研究表明MCT2仅在兴奋性Glu能突觸处表达[8]，MCT2通过pH环境的变化调节NMDA受体活性，该结构基础有利于MCT2转运乳酸进入神经元，还可灵敏调控Glu能突触后神经元动作电位的发放。

通过微透析技术和乳酸敏感性微电极记录表明，大鼠神经元电信号和行为应激时乳酸水平出现利用率增加的现象。研究发现当大鼠的心脏和肝脏内采用4-CIN阻断乳酸转运体转运过程，发现线粒体内丙酮酸转运障碍，葡萄糖和乳酸的氧化率显著降低。杨东升等[6]的研究发现力竭运动过程中及恢复期脑内乳酸水平降低，认为中枢能量物质葡萄糖和乳酸代谢下降引发神经冲动不能持续有效到达骨骼肌是导致运动性疲劳产生的重要神经生物学机制之一。此外，离体脑片上给予纹状体神经元使用NMDA诱导神经毒性实验时发现了乳酸的神经保护作用[15]，借此推测乳酸可能参与由Glu或缺氧诱导海马脑片发挥神经保护作用的预处理机制[16]。

4.3 脑内乳酸干预对GPi神经元电活动影响

神经元的电活动是神经系统传输和编码内外环境信息的基本方式之一。当前研究认为：神经元的放电模式要比放电频率、放电总数和放电比例对于基底神经节的信息整合更加重要，特别是苍白球和脚内核[17]。本实验室前期发现，运动疲劳状态下GPi神经元放电频率显著升高，平均峰峰间隔显著缩短，神经元放电活动规律性降低且爆发式放电活动增多。说明疲劳状态下GPi兴奋性增强[13]，微量注射脑乳酸阻断剂，大鼠皮层脑电功率下降、运动能力下降，表明脑内乳酸代谢受阻与皮层神经元兴奋性抑制有关，乳酸代谢障碍参与运动疲劳的中枢过程[9]。

本研究结果发现，给予4-CIN后，GPi神经元放电频率降低，规则放电神经元显著降低，不规则放电和爆发式放电均显著升高，且电活动改变与4-CIN剂量正相关，推测4-CIN阻断了星形胶质细胞和神经元之间的乳酸转运过程，导致神经元供能受损。究其机制，一方面，当给予4-CIN时，乳酸内流受阻，引起神经元膜内外pH值的改变，离子梯度变化可能会干扰沿神经轴突动作电位的传导，产生延迟响应[18]；另一方面，乳酸浓度减少导致星形胶质细胞内Glu的合成与转运不力，降低神经元Glu释放诱发动作电位发放的频率[19-20]。综上所述，4-CIN抑制乳酸转运造成乳酸转运障碍是导致神经元兴奋性降低的可能原因，神经元电活动改变的原因可能与脑内乳酸浓度的降低继发的乳酸转运障碍有关，提示乳酸在运动过程中维持脑的正常电生理活动中起着极其重要的作用。

5 结论

乳酸阻断剂4-CIN抑制了神经元与星形胶质细胞之间的乳酸转运过程，导致GPi乳酸转运障碍；脑室内注射4-CIN抑制剂，显著抑制了GPi神经元的放电活动，且抑制作用随4-CIN的浓度增加更加明显；本研究结果证实，阻断神经元对乳酸的摄取与利用，可能是导致神经元电活动变化的原因之一。endprint

參考文献：

[1] PELLERIN L. Lactate as a pivotal element in neuron-glia metabolic cooperation[J]. Neurochem Int， 2003， 43（4/5）：331.

[2] GALEFFI F， FOSTER KA， SADGROVE M P， et al. Lactate uptake contributes to the NAD（P）H biphasic response and tissue oxygen response during synaptic stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices[J]. J Neurochem， 2007， 103（6）：2449.

[3] AVITAL S， EVELYNE G. Aerobic Production and Utilization of Lactate Satisfy Increased Energy Demands Upon Neuronal Activation in Hippocampal Slices and Provide Neuroprotection Against Oxidative Stress[J]. Front Pharmacol， 2011， 2（2）：96.

[4] MAGGS D G， JONES T， JACOB R， et al. Striking differences in glucose and lactate levels between brain extracellular fluid and plasma in conscious human subjects： effects of hyperglycemia and hypoglycemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2002，22（3）：271.

[5] CHOI I Y， LEE S P， KIM S G， et al. In Vivo Measurements of Brain Glucose Transport Using the Reversible Michaelis|[ndash]|Menten Model and Simultaneous Measurements of Cerebral Blood Flow Changes During Hypoglycemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2001， 21（6）：653.

[6] 杨东升， 刘晓莉， 乔德才. 脑乳酸在运动性疲劳过程中作用机制的动态研究[J]. 天津体育学院学报， 2011，26（6）：485.

[7] 杨东升， 刘晓莉， 乔德才.“乳酸穿梭”背景下的运动性疲劳中枢机制研究新进展[J]. 中国康复医学杂志， 2012，27（3）：285.

[8] HAMANI C， FRASER J. The subthalamic nucleus in the context of movement disorders [J]. Brain， 2004，127（Pt1）：4.

[9] 胡琰茹， 乔德才， 刘晓莉.力竭运动过程中大鼠苍白球内侧部对皮层的调控作用[J]. 中国运动医学杂志， 2013， 32（5）：420.

[10] 刘晓莉， 时凯旋， 乔德才. 运动对帕金森病模型大鼠纹状体神经元电活动的影响[J]. 北京体育大学学报， 2014（5）：57.

[11] 乔德才，吴迪，侯莉娟，等.运动疲劳对大鼠黑质致密区DA能神经元电活动的影响[J]. 上海体育学院学报， 2010， 34（1）：43、.

[12] 乔德才，刘军，刘晓莉.运动疲劳的中枢机制研究进展：基于基底神经节-皮层环路紊乱的视角[J]. 北京体育大学学报， 2014（2）：51.

[13] 侯莉娟，胡荣光，刘晓莉，等.大鼠GPi/SNr神经元在运动性中枢疲劳发生中的调控作用[J]. 北京体育大学学报， 2013（5）：44.

[14] BAUNEZ C， GUBELLINI P. Effects of GPi and STN inactivation on physiological， motor， cognitive and motivational processes in animal models of Parkinson's disease[J]. Prog Brain Res， 2010， 183（92）：235.

[15] JOURDAIN P， ALLAMAN I， ROTHENFUSSER K， et al. L-Lactate protects neurons against excitotoxicity： implication of an ATP-mediated signaling cascade[J]. Sci Rep， 2016（6）：21250.

[16] BUDNI J， MOLZ S， DALCIM T， et al. Folic Acid Protects Against Glutamate-Induced Excitotoxicity in Hippocampal Slices Through a Mechanism that Implicates Inhibition of GSK-3β and iNOS[J]. Mol Neurobiol， 2017，54（1）：1.

[17] BENHAMOUL. Electrophysiological characterization of entopeduncular nucleus neurons in anesthetized and freely moving rats[J]. Front Syst Neurosci， 2014，8（7）：1.

[18] WYSS MT， RENAUD J， ALFRED B， et al. In Vivo Evidence for Lactate as a Neuronal Energy Source[J]. J Neurosci， 2011，31（20）：7477.

[19] YANG X， HE Z， ZHANG Q， et al. Pre-Ischemic treadmill training for prevention of ischemic braini Injury via regulation of glutamate and its transporter GLT-1[J]. Int J Mol Sci， 2012， 13（8）： 9447.

[20] ROBERG B A， TORGNER I A， KVAMME E. Kinetics of a Novel Isoform of Phosphate Activated Glutaminase （PAG） in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells[J]. Neurochem Res， 2010， 35（6）：875.endprint