单纯疱疹病毒型和型核酸扩增试剂盒反应体系的优化

吴颖瑩

【摘 要】目的：优化单纯疱疹病毒1型和2型核酸扩增试剂盒PCR反应体系，提高其灵敏度；方法：在PCR反应基础液配方的基础上，分别对扩增条件和反应体系中主要成分的浓度进行了优化反应参数进行扩增，经SLAN-96P荧光定量PCR仪，测定荧光强度；结果：确定了PCR反应体系的扩增条件以及主要成分的浓度比例；结论：本研究所确定的PCR反应体系灵敏度高专属性好。

【关键词】疱疹病毒1型；疱疹病毒2型；PCR优化

Optimization of reaction system of herpes simplex virus type 1 and 2 nucleic acid amplification test kit

[Abstract] Objective：To optimize the herpes simplex virus type 1 and 2 PCR reaction system， and to obtain a more efficient and sensitive kit. Methods：Based on the formula of PCR reaction base fluid， optimize the amplification conditions and the concentration of main components in the reaction system， and amplify the reaction parameters. The fluorescence intensity was determined by SLAN-96P fluorescence quantitative PCR. Results：Determine the amplification conditions of the PCR reaction system and the concentration ratio of the main components. Conclusion：The sensitivity and specificity of the PCR reaction system determined by this study are good.

[Key words] herpes virus type 1， herpes virus type 2， PCR， optimization

【中图分类号】R545.14 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）01-00-01

单纯疱疹病毒（Herpse simplex virus， HSV）是一类严重危害人类健康、引起皮肤病、性病等疾病的常见病原体。HSV是有包膜的双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，分为HSV-1和HSV-2两个血清型[1]。我国的HSV感染发病率迅速上升，近年HSV-1型的感染显著增多，因此需要对单纯疱疹病毒感染进行快速灵敏准确的诊断。随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的核酸扩增技术（PCR）由于其高敏感性和高特异性在单纯疱疹病毒的临床检测中得到广泛应用[2]。单纯疱疹病毒1型和2型核酸扩增双检试剂盒（PCR-荧光探针法）是检测单纯疱疹病毒1型和2型的一种荧光定量PCR检测试剂。它采用了高灵敏的TaqMan分子探针，使特异性和灵敏度显著提高，直接探测PCR过程中荧光信号的变化。检测过程中反应体系全封闭、灵敏度高、特异性强，为临床上各种疱疹的早期诊断提供分子生物学上的参考依据[3]。试剂盒由PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、内标模板、RNA提取液等组成。为了得到更高效灵敏的试剂盒，本研究对试剂盒PCR反应体系的主要组分及反应条件进行了优化，使其扩增达到更好的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

灭菌水，生理盐水，Taq 酶及PCR Buffer、dNTPs购自TaKaRa公司，单纯疱疹病毒1型引物、探针序列为5'-AACCACCAAGGAGCTCAAGAAC-3'；与5-（ROX）-CCACCAACCCGGACGCGTCC-（BHQ1）-3。单纯疱疹病毒2型引物、探针序列为5'-GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3'与5-（ FAM）-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-（ BHQ1） -3均购自生工生物工程（上海）有限公司，纯度99%；TaqMan探针购自生工生物工程（上海）有限公司，纯度99%。美国Stratagene實时荧光定量PCR仪SLAN-96P。

1.2 方法

1.2.1 扩增条件的优化设计：采用2步扩增法，变性温度和时间设为预变性95℃，3min，变性95℃，10s。依据引物及探针的理论Tm的计算，同时根据扩增的荧光信号及扩增的Ct比较扩增的效果，退火温度分别设置为56℃，58℃，60℃反应1分钟，40个循环，按表1 加入各反应组分及模板，离心分装后置于PCR仪中，依法操作，收集荧光信号[4][5]。

1.2.2 HSV1引物浓度的优化：以HSV1&2抽提的DNA作为模板，纯化水作为空白对照，在固定其它组分浓度的前提下，改变加入PCR反应管中的引物量，设置HSV1引物浓度分别为0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μM的5个浓度梯度。分别置于PCR仪中，依法操作，收集荧光信号

1.2.3 HSV1探针浓度的优化：以HSV1&2抽提的DNA作为模板，灭菌双蒸水作为空白对照，在固定其它组分浓度的前提下，通过改变加入PCR反应管中的HSV1探针的量，设置HSV1探针浓度分别为0.12、0.16、0.20、0.24、0.28μM的5个浓度梯度，分别置于PCR仪中，依法操作，收集荧光信号

1.2.4 HSV2引物浓度的优化：以HSV1&2抽提的DNA作为模板，纯化水作为空白对照，在固定其它组分浓度的前提下，改变加入PCR反应管中的引物量，设置HSV2引物浓度分别为0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μM的5个浓度梯度，分别置于PCR仪中，依法操作收集荧光信号endprint

1.2.5 HSV2探针浓度的优化：以HSV1&2抽提的DNA作为模板，灭菌双蒸水作为空白对照，在固定其它组分浓度的前提下，通过改变加入PCR反应管中的探针的量，设置HSV2探针浓度分别为0.12、0.16、0.20、0.24、0.28μM的5个浓度梯度，分别置于PCR仪中，依法操作，收集荧光信号

1.2.6 内标引物浓度的优化：以HSV1抽提的DNA作为模板，纯化水作为空白对照，在固定其它组分浓度的前提下，改变加入PCR反应管中的内标引物量，设置内标引物浓度分别为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14μM的5个浓度梯度，分别置于PCR仪中，依法操作，收集荧光信号

2 结果

2.1 反应条件优化结果见图1-图3，曲线虚线表示HSV1扩增曲线，实线表示HSV2扩增曲线，点划线表示内标扩增曲线。由图可以看出，三种反应条件中，第三种得到的荧光信号强，且曲线呈S型，因此本实验选择最佳退火温度为60℃。并最终确定的反应条件为：50℃ 2分钟；95℃ 3分钟；95℃ 10秒、60℃ 1分钟，40个循环。

2.2 在PCR反应基础液配方的基础上，本研究分别对反应体系中主要成分的浓度进行了优化反应参数进行扩增，经SLAN-96P荧光定量PCR仪上机后，实验结果如图4-图8所示：

由圖4和图6可知随着HSV1和HSV2引物浓度的增高，Ct值基本一致。当HSV1和HSV2引物浓度为0.40μM时，反应结束后的荧光信号强度最高，确定HSV1和HSV2引物的浓度均为0.40μM。由图5和图7所知，5种不同浓度的HSV1和HSV2探针进行PCR扩增，当探针的浓度为0.20μM时，反应结束后的荧光信号强度最强，本实验确定的最佳HSV1和HSV2探针浓度均为0.20μM。由图8可以看出，随着引物浓度的增高，Ct值基本一致。当内标引物为0.10μM时，内标扩增曲线呈S型，且荧光信号强度较强。最终确定内标引物的浓度为0.10μM。

3 讨论

在本项研究中，单纯疱疹病毒1型的TaqMan探针的基团设计为ROX，ROX的吸收光波长为575 nm，发射光波长为602 nm。单纯疱疹病毒2型的TapMan探针的基团设计为FAM，FAM的吸收光波长为494nm，发射光波长为525nm，因此彼此不会相互干扰。

本研究基于TaqMan探针技术与实时荧光PCR仪的结合，对实时荧光PCR反应体系中主要组分用量及浓度进行了优化并得到最佳处方；在退火温度上进行了梯度试验摸索，退火温度设置为60℃，退火时间设置为1min，依次反复试验，从而使HSV1的检测均能在同一应条件下进扩增而达到较好的效果。本试剂盒经反应体系的优化后，检测更佳高效，灵敏度更好。

参考文献

侯熙德. 神经病学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 1986. 138- 139.

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赖迪辉，朱威，连石. 单纯疱疹病毒实验室检测方法的研究进展[J]. 中国计划生育学杂. 2010， 6： 380-381

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