抗炎寡肽EA—230的固相合成

陈科　李乾　郭添　李晨　杨小琳　赵金礼

【摘 要】目的：本文介绍一种抗炎寡肽EA-230（氨基酸序列为Ala-Gln-Gly-Val）的固相合成方法。实验在无水体系中以2-氯三苯甲基氯树脂为载体以Fmoc-保护的氨基酸为原料在DIC/HOBt体系中合成EA-230。目标产物收率高，杂质少，结构经质谱与标准品对照一致。本文的合成方法操作简单，副产物少，重复性高，适用于批量生产制备。

【关键词】EA-230；寡肽；2-氯三苯甲基氯树脂；固相合成

[Abstract] in this paper，an anti-inflammatory oligopeptide （EA-230）is introduced，which is based on 2-CTC resin with a peptide solid phase，and protected Fmoc-amino acid in DIC/HOBt solution. The synthesized target has high yield and purity， and the structure is right by LC-MS with the standard. It is simple and suitable to synthesize the product for much batches with this method and has little impurities.

[Key words] EA-230；oligopeptide；2-CTC resin；solid phase

【中图分类号】R979.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）01-0-01

寡肽EA-230，又称AQGV或者NMPF-46或者peptide-46，其氨基酸序列位Ala-Gln-Gly-Val，是一种具有抗炎作用的人绒毛膜促性腺激素相关的寡肽[1]，在脓毒症和脓毒性休克以及缺血性修复方面有很好的疗效[1][2]，正在进行的临床试验表明，其在肾衰竭方面的治疗具备很好的效果。

日臻成熟并不断发展的生物技术与多肽合成技术使得越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。多肽药物因其适应症广、安全性高且疗效显著的特点，目前已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病、心脑血管等疾病的预防、诊断和治疗，多肽药物的开发已经发展到疾病防治的各个領域，具有广阔的开发和应用前景。随着新药研发的不断深入，目前多肽药物的开发已经发展到疾病防治的各个领域如抗肿瘤、抗病毒、多肽疫苗、细胞因子模拟、抗菌、诊断、减肥等诸多方面。

寡肽是指氨基酸数目在10个左右的小分子多肽，其可以如小分子那样穿越细胞膜，通过生理屏障，穿过血脑屏障，因而被用作药物载体来辅助这些药物穿过细胞膜。同时，一些多肽可以用作非靶向特异性的小分子药物的靶向载体，通过细胞表面的特定受体将药物传递到受体特异性的特定靶点细胞如肿瘤细胞内。多肽由于其降解后的产物为氨基酸，一般不会在特定器官组织中累积，容易通过肝和肾从体内很快被清除掉，目前几乎没有发现由于异物代谢引起的毒理学等问题，因而，一般没有副作用或者副作用很小。

大量的生物试验表明EA-230能有效减轻大鼠同种异体肾移植后急性肾损伤和缺血性损伤[3]，能有效改善因衰退性炎症和肝损伤（创伤）的出血引起的冲击和复苏[4]，减少鼠和恒河猴的脓毒性休克引起的死亡率[2]，对肾缺血再灌注损伤有较好的改善作用[1]，有文献研究表明其于大鼠的妊娠有关系[5]。由于其在由肾衰竭引起的抗脓毒性休克和出血方面有优异的效果，正处于临床二期。由于其是“人源性肽”，安全性非常高。

目前，国际、国内关于小分子多肽的研究比较多，然而关于寡肽EA-230的合成案例非常少。本文主要介绍一种固相合成寡肽EA-230的方法，以2-氯三苯甲基氯树脂为载体、以Fmoc保护的氨基酸为原料、按照其氨基酸序列逐个延伸缩合为方法，合成目标肽链，将其酸解脱去树脂可得到目标产物的粗品，然后再对粗品进行鉴定和纯化得到最终产品[6]。

一、实验部分

1.主要的原料和试剂

Fmoc-Ala-OH（吉尔生化上海有限公司）；Fmoc-Gln（trt）-OH（吉尔生化上海有限公司）；Fmoc-Gly-OH（吉尔生化上海有限公司）；Fmoc-Val-OH（吉尔生化上海有限公司）；DMF（分析纯，西安浩业化工有限公司）；DIC（吉尔生化上海有限公司）；HOBt（吉尔生化上海有限公司）；DIEA（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；DCM（分析纯，西安浩业化工有限公司）；异丙醇（分析纯，西安浩业化工有限公司）；哌啶（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，西安浩业化工有限公司）；2-CTC Resin（天津南开大学树脂有限公司）。

2.主要仪器

超声波清洗器（昆山市仪器有限公司 KQ-500B）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司 SHB-Ⅲ）、电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司 SE6001F）、制备高效液相色谱仪（创新通恒LC3000）、分析高效液相色谱仪（日立全自动L2000系列）、C18分析色谱柱（大连物理化学研究所4.6mm×250mm）、弱阴离子交换柱（自填体积为150mL 保赛生物科技公司填料 粒径为45～165μm的DEAE高流速琼脂糖微球）、C18制备色谱柱（成都科谱生物有限公司50mm×450mm）。

3.试验方法

（1）树脂活化将3.0g 2-CTC-Resin树脂（批号：G55S1133-2 ，交联度：1%DVB 粒径：100-200目， 取代度：1.05 mmol/g）加入反应器中，加入50mL DCM，室温搅拌浸泡5-15分钟使其充分溶胀活化；

（2）合成Fmoc-Val-2-CTC Resin肽树脂endprint

在步骤（1）的树脂中加入Fmoc-Val-OH（1.18g）、DIEA（2.1ml）、DCM 50ml，室温搅拌反应2小时，抽滤除去溶液，继续加入Fmoc-Val-OH（1.07g）、HOBt（0.85g）、DIC（0.98ml）、DMF适量，室温反应1小时，抽滤除去溶液，树脂用30ml异丙醇和30ml DMF各进行洗涤两次，得到FmoFmoc-Val-2-CTC Resin肽树脂；

（3）将步骤（2）树脂肽中加入30ml 20%哌啶的DMF溶液，室温搅拌反应30分钟。抽滤去除溶液，再用50ml异丙醇和50ml DMF各进行洗涤两次，得到H-Val-2-CTC Resin肽树脂，茚三酮检测显阳性。

（4）合成Fmoc-Gly-Val-2-CTC Resin肽树脂

在步骤（3）的树脂中加入Fmoc-Gly-OH（1.88g，2当量）、HOBt（1.28g，3当量）、DIC（1.47ml，3当量）、DIEA（2.1ml，4当量 ）、DMF100ml，室温反应2小时，茚三酮检测显阴性，抽滤去除溶液，再用50ml异丙醇和50ml DMF各进行洗涤两次，得到Fmoc-Gly-Val-2-CTC Resin肽树脂；

（5）将步骤（4）树脂肽中加入50ml 20%哌啶的DMF溶液，室温搅拌反应30分钟。茚三酮检测显阳性，抽滤去除溶液，再用50ml异丙醇和50ml DMF各进行洗涤两次，得到H-Gly-Val-2-CTC Resin肽树脂。

（6）合成H-Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽树脂

重复步骤（4）～（5），依次连接Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Ala-OH，得到Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽树脂；树脂肽最后用50ml甲醇洗涤三次，干燥得4.5g H-Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽树脂。

（7）配制30ml树脂切割液：将三氟乙酸、三异丙基硅烷、水、苯甲硫醚按体积比为88：5：3：4加入到烧杯内搅拌混合；

树脂切割：将4.5g树脂加入到上述配置的30ml切割液中，室温搅拌反应1.5小时，抽滤，滤液控制不高于40℃减压脱除至基本无馏分，向其中加入30ml甲基叔丁基醚，超声分散2小时后静置1小时，过滤，固体用10ml甲基叔丁基醚洗涤，干燥得白色粗品肽1.5g。

二、结果讨论

由图中从分析图可以看出纯度>97%，得到純品1.12g，产率 95.72%。

三、结论

本文介绍了一种固相法合成EA-230的方法，具有操作简单快捷，纯度高，易于分离纯化，可重复性高的特点。相较于传统的液相合成方案，解决了谷氨酰胺溶解性差和不稳定的特点，合成时间短，操作步骤少，较大的减少了生产时间和纯化成本，为以后批量生产提供了一种行之有效而又简单便捷的方法。endprint