半干旱区两种草原类型植物体内草酸钙研究

李梦琦， 何兴东*， 杨祥祥， 丁新峰， 赵月丹， 高玉葆，尤万学， 余 殿， 蔡 莉

(1. 南开大学生命科学学院， 天津 300071； 2. 宁夏哈巴湖国家级自然保护区管理局， 宁夏 751501)

草酸钙是植物体内钙的一种生物矿化形式[1-2]，广泛分布于植物不同组织及器官中[2-3]。在藻类、低等维管植物、裸子植物和被子植物中，均发现草酸钙晶体的沉积，其中以高等植物体内含量最为丰富[4-6]。草酸钙在植物中主要是以一水草酸钙(CaC2O4·H2O，COM，单斜晶系)的形式存在，以二水草酸钙(CaC2O4·2H2O，COD，四方晶系)形式存在的数量极少且不稳定[4,7]。草酸钙晶体的形态和大小各异，常见的晶体形态包括针晶体、柱状晶、多种形状的棱柱晶、晶体砂和晶簇5类[6-8]。草酸钙晶体通常在植物组织里一种特化细胞的液泡中聚积，这种细胞被称为含晶异细胞(crystal idioblast)[7-9]，可简称含晶细胞或者晶异细胞。

植物体内草酸钙晶体是由内源合成的草酸和外源吸收的钙离子(Ca2+)共同反应形成的产物，这一过程并不是简单的化学沉淀，而是由严格的遗传调控的[10]。草酸钙晶体具有一定的形态特征，可能与植物的防御、保护有关[5]。晶体的形成能够抵御昆虫、牲畜等的取食[9-12]。此外，草酸钙晶体的形成也是一种钙调节机制[13]。草酸钙是提供细胞Ca2+的临时“钙库”，在维持胞内外Ca2+平衡、提高植物抗逆性及维持细胞在逆境条件下的正常生长发育等方面担负着重要作用[14]。尽管钙离子对植物的生长发育非常重要，但是高浓度的游离钙离子对细胞是有毒害的，草酸钙的沉淀可以消除过量的游离钙离子，并且将钙贮藏，以备不时之需[15]。针晶体的形成既和Ca2+调节有关，又与植物防御有关，而晶簇(球形)的形成只和Ca2+调节有关，且晶簇的形成随Ca2+水平波动[10]。含晶细胞有较高的渗透势，在外界环境水分状况较好和导管中水分输导良好时，它们吸收并贮存水分；当外界环境干旱缺水时，导管中水分输导受阻，不能正常供给植物体内各部分对水分的需求时，它们可为周边细胞提供一个较为湿润的小环境，从而提高植物的抗旱性[10]。草酸钙还参与重金属脱毒的过程[5,16]。微量的铝就能抑制根的生长，影响植物获得水分和养料，而植物体内草酸钙晶体可以和铝结合，草酸也可以和铝螯合形成无毒的草酸铝[5]，从而减轻毒害。草酸钙其他功能还有光的聚集反射和组织支持等[4,10,17-18]。综上所述，植物草酸钙具有重要的生态学意义。

以往植物体内草酸钙的测定都是采用显微技术观察晶体[2,8,13]，很少用化学方法测定不同植物体内草酸钙的含量，相对而言，用化学方法测定更简便快捷。本研究用钙测定的连续组分法[19-20]测定了宁夏盐池北部的宁夏哈巴湖国家级自然保护区(植被为荒漠化草原)和内蒙古正蓝旗中北部(植被为典型草原)植物体内的草酸钙，旨在服务于植物的抗逆生理和受损植被的恢复研究。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

实验植物样品采自半干旱区两个草原植被带，即宁夏盐池县北部的宁夏哈巴湖国家自然保护区和内蒙古正蓝旗中北部的桑根达来东南部。宁夏盐池县宁夏哈巴湖国家自然保护区属荒漠化草原带，经纬度106°53′11″～107°38′10″ E，37°38′36″～38°02′00″ N，海拔1 300～1 622 m，年均气温7.7℃，年均降水量296.5 mm，年均蒸发量2 131.7 mm；土壤属流动风沙土、半固定风沙土和固定风沙土，植物群落主要为生长在流动、半固定和固定沙地的沙柳(Salixpsammophila)群落和油蒿(Artemisiaordosica)群落，主要植物有沙柳、油蒿、虫实(Corispermumdeclinatum)、黄蒿(A.scoparia)、阿尔泰狗娃花(Heteropappusaltaicus)、地稍瓜(Cynanchumthesioides)、白草(Pennisetumcentrasiaticum)、长芒草(Stipabungeana)、赖草(Aneurolepidiumdasystachys)、华灰早熟禾(Poasinoglauca)、糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)、苦豆子(Sophoraalopecuroides)、沙地旋复花(Inulasalsoloides)、草木樨状黄芪(Astragalusmelilotoides)、披针叶黄华(Thermopsislanceolata)和杨柴(Hedysarummongolicum)等。内蒙古正蓝旗属典型草原带，经纬度115°00′～116°43′ E，41°56′～43°07′ N，海拔1 300～1 600 m，年均气温1.5℃，年均降水量370.7 mm，年均蒸发量1 931.4 mm。土壤属栗钙土、淡栗钙土和固定风沙土，植物群落主要为克氏针茅(Stipakrylovii)群落、羊草(Leymuschinense)群落、榆树(Ulmuspumila)群落和小叶锦鸡儿(Caraganamicrophylla)群落，主要植物有克氏针茅、羊草、榆树、小叶锦鸡儿、狼毒(Stellerachamaejasme)、黄囊苔(Carexkorshinskyi)、糙隐子草、展枝唐松草(Thalictrumsquarrosum)、麻花头(Serratulachinensis)、地榆(Sanguisorbaofficinalis)、达乌里龙胆(Gentianadahurica)、星毛委陵菜(Potentillaacaulis)、菊叶委陵菜(Potentillatanacetifolia)、北芸香(Haplophyllumdauricum)、大花飞燕草(Delphiniumgrandiflorum)和叉分蓼(Polygonumdivaricatum)等。

1.2 实验方法

1.2.1样品采集 2016年7月在宁夏盐池县境内的宁夏哈巴湖国家级自然保护区采集91种植物，2017年7月在内蒙古正蓝旗桑根达来采集77种植物。每种植物分别选择3株，每种采集叶3～5 g，装于纸袋中，带回实验室。在实验室，将植物样阴干，两个月后用于草酸钙含量测定。

1.2.2草酸钙含量测定 根据本实验室之前研究中摸索得出的方法，每种植物样品称取2份，每份质量在0.01～0.02 g，置于2个研钵中，分别加入1 mL的1. 05 mol·L-1稀醋酸和1 mL的1 mol·L-1稀盐酸，研磨成匀浆，转移到7 mL的离心管中；再分别加入相应溶液4 mL冲洗，转入离心管；7 000 rpm离心15 min，得到的上清液即为提取液。在2个50 mL的锥形瓶中分别加入0.94 mL和0.91 mL的4 mol·L-1NaOH，再分别加入去离子水1.06 mL和1.09 mL，然后均加入3 mL提取液和3 mL三乙醇胺(1：2水溶液)。在配好的溶液中加入钙羧酸指示剂0.08 g，用标定好的EDTA溶液滴定，当溶液的颜色由紫红色变为亮蓝色时停止滴定，记录滴定液的体积。草酸钙含量的计算公式为：草酸钙含量/mg·g-1=

式中：CEDTA为EDTA溶液的浓度，V"EDTA为盐酸处理组所用EDTA的体积，m"为盐酸处理组的样品质量，V＇EDTA为醋酸处理组所用EDTA的体积，m＇为醋酸处理组的样品质量。

1.3 数据分析

根据相关参考文献[21,24]，对两地植物所属光合途径类型进行统计。用SPSS 22.0软件对两地禾本科草本和非禾本科草本草酸钙含量之间的差异以及C3植物和C4植物草酸钙含量之间的差异进行独立样本t检验，用Excel 2016作图。

2 结果与分析

2.1 宁夏哈巴湖自然保护区和内蒙古正蓝旗采集植物叶草酸钙

在宁夏哈巴湖国家级自然保护区，草酸钙含量最高的植物是猪毛菜(Salsolacollina)(105.77 g·kg-1)、沙蓬(Agriophyllumsquarrosum)(94.28 g·kg-1)、尖头叶藜(Chenopodiumacuminatum)(75.49 g·kg-1)、草原石头花(Gypsophiladavurica)(73.92 g·kg-1)、虫实(Corispermumdeclinatum)(63.28 g·kg-1)，草酸钙含量最低的植物是沙鞭(Psammochloavillosa)(0.90 g·kg-1)和长芒草(Stipabungeana)(1.19 g·kg-1)(表1)。

在内蒙古正蓝旗桑根达来，草酸钙含量最高的植物是灰绿藜(Chenopodiumglaucum)(84.87 g·kg-1)、猪毛菜(61.10 g·kg-1)、碱地肤(Kochiascopariavar.sieversiana)(50.90 g·kg-1)，草酸钙含量最低的植物是糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)(0.65 g·kg-1)、阿尔泰狗娃花(Heteropappusaltaicus)(1.23 g·kg-1)、披针叶黄华(Thermopsislanceolata)(1.30 g·kg-1)、苦荬菜(Ixerisdenticulata)(1.48 g·kg-1)(表1)。

2.2 C3植物和C4植物体内草酸钙含量比较

在宁夏哈巴湖国家级自然保护区，所采集到的C4植物有猪毛菜、沙蓬、尖头叶藜、白草(Pennisetumcentrasiaticum)、碱地肤、雾冰藜(Bassiadasyphylla)、中亚滨藜(Atriplexcentralasiatica)、蒺藜(Tribulusterrester)、虎尾草(Chlorisvirgata)和糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)；在内蒙古正蓝旗，所采集到的C4植物有灰绿藜、猪毛菜、碱地肤、木地肤(K.prostrata)、白草、狗尾草(Setariaviridis)、大籽蒿(Artemisiasieversiana)、展枝唐松草(Thalictrumsquarrosum)和糙隐子草；除了哈巴湖自然保护区的地木耳(Nostoccommune)和发菜(N.communevar.flagelliforme)，两地其他植物均为C3植物。统计结果表明，两地C4植物的草酸钙含量均显著高于C3植物的草酸钙含量(P<0.05)(图1)。

2.3 两地禾本科草本和非禾本科草本体内草酸钙含量对比

哈巴湖自然保护区的样地为荒漠化草原，正蓝旗的样地为典型草原，两地植被都是以草本为主。禾本科和非禾本科植物草酸钙含量统计结果表明，在哈巴湖自然保护区和正蓝旗，非禾本科草本植物的草酸钙含量均显著高于禾本科草本(P<0.05)，而两地间的差异不显著(图2)。

表1 半干旱区草原带两地植物体内草酸钙含量Table 1 Contents of calcium oxalate in plants of both vegetation zones in semi-arid area

续表1

图1 宁夏哈巴湖和内蒙古正蓝旗两地C3植物和C4植物草酸钙含量比较Fig.1 Comparison of calcium oxalate contents between C3 plants and C4 plants for the Ningxia Habahu National Nature Reserve and Zhenglan Qi County of Inner Mongolia注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

图2 宁夏哈巴湖和内蒙古正蓝旗两地禾本科草本和非禾本科草本草酸钙含量比较Fig. 2 Comparison of calcium oxalate contents between grass and herb in the Ningxia Habahu National Nature Reserve and Zhenglan banner of Inner Mongolia

3 讨论

植物草酸钙具有显著的钙库功能和植物抗逆与植物防御功能[4,7,9]。草酸钙含晶细胞多集中在沙生、旱生植物的叶和轴器官中，被认为是荒漠植物抗旱结构特征之一[10]。积累草酸钙的晶异细胞具有较高的渗透势，在水分状况好时吸收贮存水分，在干旱的时候可以给周边细胞提供较为湿润的小环境，增强抗旱性[10]。严巧娣等对几种荒漠植物含晶细胞比较的研究表明[8]，草酸钙晶体主要在栅栏组织、贮水组织和维管束中出现，而这正是Ca2+从土壤到根、茎、叶的运输通道，这一点也印证了草酸钙晶体增强抗旱性的作用。本研究结果表明，宁夏哈巴湖和内蒙古正蓝旗的沙生植物(如猪毛菜、沙蓬、虫实、雾冰藜、尖头叶藜)、旱生植物(如驼绒藜、骆驼蓬、荒漠锦鸡儿、草原石头花)和盐生植物(如碱地肤、白刺)草酸钙含量相对较高。这些植物都对干旱或盐碱环境的适应力很强，它们体内积累的草酸钙也许是使其能够适应或抵抗不良环境的原因之一，这说明草酸钙的积累是植物适应环境的一种方式。一般来说，降水越少，水分条件越差，植物抗旱性越强[25-27]。宁夏哈巴湖降水相对内蒙古正蓝旗较少，哈巴湖年均降水量296.5 mm，正蓝旗年均降水量370.7 mm，哈巴湖植物草酸钙含量最高的前十个值都比正蓝旗相应值要高。显然，生境越干旱，植物体内草酸钙含量会越高。因此，可以认为，草酸钙含量越高，植物抗胁迫能力越强。

值得指出的是，植物体内草酸钙含量影响草本植物被牲畜取食的适口性。草酸钙的形成对于某些植物来说似乎是一种诱导的防御反应[16]。Ward等[28]研究表明，全能花属植物Pancratiumsickenbergeri只有叶片的尖端会遭到瞪羚(Gazelladorcas)啃食，而叶片尖端正是整个叶片中唯一没有草酸钙针晶的部分。Nakata发现，植物Tragiaramosa的刺毛里有草酸钙针状晶体，当动物接触时，这些晶体释放，刺穿动物表皮，甚至注入毒素，影响动物取食，起到自我保护的效果[29]。本研究结果表明，同属半干旱区草原带的宁夏哈巴湖和内蒙古正蓝旗，均是禾本科草本的草酸钙含量显著低于非禾本科草本。在荒漠化草原带的宁夏哈巴湖，禾本科草本的草酸钙含量比非禾本科草本低56.37%；在典型草原带的内蒙古正蓝旗，禾本科草本的草酸钙含量比非禾本科草本低45.29%。在正蓝旗，即使是禾本科草本植物，牲畜适口性好的糙隐子草、羊草、洽草、冰草、赖草等体内草酸钙含量很低，它们的草酸钙含量分别是大针茅的5%，44%，48%，49%，51%，因此，在夏季牲畜不喜吃大针茅，而在冬季没草了牲畜才吃大针茅，因而，大针茅表现出一定的耐牧性[30]。一般而言，牲畜较喜欢啃食禾本科植物，而禾本科植物体内草酸钙含量较少，可见，草原植物体内的草酸钙含量越多，对于草食动物来说适口性越差。

本研究结果表明，在宁夏哈巴湖国家级自然保护区和内蒙古正蓝旗，C3植物体内草酸钙含量相对较低，而C4植物体内草酸钙含量相对较高。一般而言，陆地植被是由约95%的C3植物和5%的C4植物组成，而C4植物水分利用效率高于C3植物，CAM(Crassulacean acid metabolism景天酸代谢)植物具有最高的水分利用效率[24]。显然，C3植物和C4植物光合途径是植物长期适应自然的结果，草酸钙含量的差异也是植物长期适应自然的结果。

在腾格里沙漠，多年生草本草酸钙含量较低，一年生草本显著偏高[19]。徐静静等[20]研究表明，在天津盐渍化生境中，从乔木、灌木、藤本到草本，植物体内盐酸溶性钙含量逐渐减少，草本植物鹅绒藤(Cynanchumchinense)和芍药(Paeonialactiflora)体内未镜检到草酸钙晶体。本研究结果表明，多种一年生的藜科植物的草酸钙含量较高。这个结果和先前的研究并没有本质上的不同。禾本科植物抵御干旱逆境的机理研究其实多偏重基因角度。而从形态上看，为了应对干旱胁迫，禾本科草本会通过叶片萎蔫、卷曲等方式减少蒸发面积，通过增加维管束，加厚表皮细胞角质层，增加细根量等保证植物体内水分和营养物质的运输[31]。比起形成草酸钙晶体，禾本科植物似乎更倾向于选择形态变化，或者吸收Ca2+来抵抗轻度胁迫，这也是与长年生活于干旱或盐碱土地的藜科等植物不同的应对策略。

4 结论

在半干旱区的宁夏哈巴湖国家级自然保护区和内蒙古正蓝旗，禾本科草本草酸钙含量显著低于非禾本科草本，牲畜相对更喜取食禾本科植物，显然，草酸钙含量的增多降低了植物被牲畜猎食的适口性，影响草食动物的取食。两地C3植物体内草酸钙含量均显著低于C4植物体内草酸钙含量。可见，草原植物体内草酸钙含量的多少是其长期进化适应环境的结果。两个草原类型间植物草酸钙含量没有显著差异，可以推测同在半干旱区的不同草原类型可能有相似的生理特征。