基因测序技术在食品检测领域的应用

◎ 王敏峰

（上海市酒类产品质量检验中心有限公司，上海 200081）

1 基因测序技术

在分子生物学研究中，DNA序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前，用于测序的主流技术有2类：①传统测序技术，或称为第一代测序技术，以双脱氧链终止法（Sanger测序法）为代表。②近几年发展起来的下一代测序技术（NGS测序技术），又被称为高通量测序技术，其测序原理有边合成边测序、单分子测序和纳米孔测序。具体来说，边合成边测序（也称为第二代测序技术）以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为代表；单分子测序（也称为第三代测序技术）以Helicos Bioscience公司的HeliScope遗传分析系统和Pacific Biosciences公司的PacBio RS单分子实时测序系统为代表；纳米孔测序（也称为第四代测序技术），Oxfold Nanopore Technologies 公司的GridION和MinION等为代表[1]。

测试技术的飞速发展，使检测通量有了革命性的改进，同时大大降低了测序成本。此外，消费者对于食品安全越来越重视，无论是生产者、消费者还是监管检测机构，都需要开发更精确、更高效的检测方法，基因测序技术正迎合了这样的需要，故而，基因测序技术与食品检测领域的结合也应运而生。

2 基因测序技术在食品检测中的应用

2.1 食品中成分的检测

任何人为或者意外导致的食品掺假和污染都是不可接受的，但各种食品原料（如各种禽畜肉类、水产类）间巨大价差所带来的丰厚利润，使得此类事件层出不穷，国内国外都屡见不鲜。食品中掺入的其他未标注成分也增加了食品过敏的风险，从国内的“挂羊肉卖鸭肉”到欧洲的“马肉风波”，各种食品危机、食物过敏和食品欺诈的发生将摧毁消费者对于食品安全的信心，也伤害了行业的健康发展。生产者、消费者、监管机构对食品供应链潜在风险的警觉意识大大提高，据不完全估算，全球食品行业每年需耗费100亿～150亿美元应对这类食品欺诈。因此，希望在食品加工和生产中的上述风险都是可识别和可预防的。

利用PCR技术对食品中的成分进行基因检测，阳性结果用测序技术加以验证，这已经是一种非常成熟的技术。我国的很多国家标准和行业标准都采用了这种技术来应对食品掺假欺诈及对过敏成分进行检测，如GB/T 20190-2006《饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法》、GB/T 23815-2009《猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法》、GB/T 23814-2009《莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法》、SN/T 2978-2011《动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法》、SN/T 3730.4-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴成分检测 实时荧光PCR法》、SN/T 3730.5-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分：马成分检测 实时荧光PCR法》、SN/T 3730.2-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第2部分：狗成分检测 实时荧光PCR法》、SN/T 2867-2011《饲料中鱼源性成分定性检测方法PCR方法》、SN/T 3731.1-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第1部分：鹌鹑成分检测 PCR法》、SN/T 3731.2-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第2部分：鹅成分检测 PCR法》、SN/T 3731.3-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第3部分：鸽子成分检测 实时荧光PCR法》等。

但是，PCR技术有个很大的缺陷，只能定性检测，无法定量分析，无法分辨食品中含有的其他成分是恶意掺假还是由于共用生产线或生产器具等无法避免的原因造成的污染。

近年来，利用下一代测序技术（NGS测序技术），可以实现食品中各种动物源性成分的定量分析，而且这种技术已经投入商业应用中，一些大型检测机构已经可以提供此项检测服务。

2.2 特定物种分析

即便是同类原料，由于产地不同、品种不同，其价值会有巨大差异，但普通消费者又很难通过外观、口感等加以区分，尤其当原料经过加工后，如水产品被去头、去皮、去骨后，甚至再经烟熏、腌制等工艺。即便是专业人士，想要准确无误地判断产地、品种也非易事。

利用PCR技术，以16S rRNA基因的通用引物扩增鱼类样品的16S rRNA或其他特征基因片段，用测序技术分析其基因序列，再与权威发布的基因组数据库进行比对，从而在基因层面上，确定原料的品种、产地信息。

运用这种技术制作物种鉴定的DNA条形码，在技术层面上杜绝这类混淆品种的食品欺诈行为，是各国食品监管部门和检测机构的手段之一。传统的测序技术通常适用于初加工的水产制品，对于深加工的产品会有很多困难。下一代测序技术在深加工水产制品的种类鉴定上会发挥更多的作用。

2.3 食源性微生物的分析

食品工业的规模化进程、食品流通的广泛性和快速性、农场生产模式的转型、饮食习惯的变化，甚至国内和国际旅游人群的增加都是食源性疾病发病率升高、扩散速度加快的重要原因，食源性疾病已经成为全球公共卫生面临的最严峻挑战之一。在发达国家，每年患食源性疾病的人数高达30%；在美国，每年每6人中就有1人因为食用被污染的食品而生病，每年仅是沙门氏菌感染造成的直接医疗费用损失就达到3.65亿美元，发展中国家的情况更加令人担忧。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年5岁以下儿童的腹泻病例达15亿例次，造成约300万个儿童死亡，其中，70%是由各种致病微生物污染的食品和饮水所致。据卫生部关于全国食品中毒事件情况的通报数据，仅2015年，全国微生物性食物中毒案例报告数为57起，占比33.73%；中毒人数3 181人，占比53.68%；死亡人数8人，占比6.61%，而这仅是实际发病人数的“冰山一角”。世界卫生组织估计发展中国家的漏报率高达95%以上。

食源性疾病作为食品安全的主要问题，世界卫生组织将其定义为“凡是通过摄食进入人体的，引发人体罹患感染性或中毒性的疾病”，其中包括由食品微生物污染和化学性物质引起的食源性疾病，微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要组成。因此，有必要加强对食源性致病菌在基因水平上的深入研究。要把预防和控制产业链中食源性致病菌污染作为重点，降低致病菌污染率。

利用测序技术可在信息缺乏或多种微生物存在的情况下对食源性致病微生物进行检测判定，可在基因序列的背景下更科学地认识食源性致病菌的遗传特性、代谢能力、致病机制等，为食源性微生物疾病预防和控制提供重要的依据。

例如，沙门氏菌（Salmonellae）是一种极为常见的食源性致病菌，在细菌性食物中毒都占有极高的比例，人类会通过多种途径被感染。Ashton等[11]使用Illumina HiSeq2500测序技术对2013年爆发的沙门氏菌进行了全基因组的测序分析，证明了蛋黄酱中分离得到的鼠伤寒沙门氏杆菌DT 8（Salmonella typhimuriumDT 8）是导致人类感染的病原菌。

2011年5—7月，在德国由于大肠埃希菌（Escherichia coli O104:H4）污染生食蔬菜沙拉中的芽苗菜，导致了流行病的爆发。E. coliO104:H4是近年来新发现了一种血清型，其产生的志贺毒素导致腹泻和溶血性尿毒综合征。Rasko等[12]使用SMRT三代测序技术对大肠埃希菌（O104:H4）和7种来自非洲的肠致病型大肠埃希菌（O104:H4）以及4株属于其他血清型的肠致病型大肠埃希菌（O104:H4）的参考菌株进行全基因组测序。结果显示，导致德国疾病暴发的大肠埃希菌不同于其他的大肠埃希菌（O104:H4）菌株，属于大肠杆菌属系统发育树下的另一个分支，因该菌株携带编码的志贺毒素的前噬菌体和耐抗生素基因序列，所以对人体危害巨大。

3 应用前景

相对其他的食品检测技术，测序技术在食品检测和食品安全监管领域中起到的作用还在起步阶段，仍需继续努力，不断完善。相信在不远的未来，测序技术将更多地普及到各行各业，甚至成为未来实验室分析以及食品安全检测的常规检测手段。