采用多菌种酿造酱油技术及应用于工业生产的研究进展

◎ 闫冬梅，邓远均，刘 凯，黄永杰（.西昌学院，四川 西昌 65000；.西昌市生生调味品有限公司，四川 西昌 65000）

酱油也叫鼓油，是利用大豆、小麦等原材料，然后经过制曲、发酵等过程酿造出来的调剂品。最开始，酱油是从酱演变而来的，酱油的酿造也是偶然间发现的，源于中国古代皇帝御用的调味品。酱油最开始是用鲜肉腌制而成，与现在生产鱼露的过程相同。之后，由于其风味绝佳慢慢地在民间兴盛起来，渐渐地，人们发现其与大豆制成的风味相近，而且用大豆酿制价格便宜，所以该方法便广泛流行。酱油对菜肴的味道以及色泽有着积极影响。微生物在酱油酿造的过程中发挥着作用，分泌的酶具有催化作用，然后参与复杂的生化反应中。在酱油的发酵过程中，重要次生菌群对酱油风味的形成有非常大的影响。其中，制曲是酱油发酵非常关键的环节，制曲的本质就是根据微生物在酿造原料上繁殖生长的作用，生成许多的淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等酶类，它们会在发酵期发挥作用。

1 高盐稀态和低盐固态酱油酿造工艺及其区别

高盐稀态和低盐固态是两种主要的酱油生产发酵方式。研究发现，高盐稀态发酵酱油在发酵过程中，其酵母菌（microzyme）及乳酸菌（lactobacillus）等次生菌群较多，因为其发酵周期长，对酱油风味的形成有着积极影响，可使酱油的香味浓郁、感官品质好，但是发酵周期长，会导致高盐稀态酱油的产量偏低，工业生产的规模较小；低盐固态发酵主要以米曲霉为主，与高盐稀态发酵相反，其周期短，但是对酱油风味的形成有积极作用的次生菌群较少，因此所酿造出来的酱油风味及感官品质较差。

低盐固态法是目前我国酱油行业普遍采用的酿造工艺，产量占到我国酱油年产量的90%，但是这种方法不能有效地利用其蛋白质原料。查阅相关文献，中国在低盐固态酱油中对全氮利用率仅为66%左右，而日本对全氮的利用率最高在92%以上。

1.1 酱油中乳酸菌种的分布及其作用

乳酸菌在酱油的制曲和发酵中发挥的作用不可忽视，是酱油酱醅中的主要细菌，是一种耐盐的菌种。①乳酸菌在酒醅中的繁殖生长减小了酱醅的pH值，因此控制了杂菌的生长，促进了能生成酱油风味的菌种的生长，如球拟酵母和鲁氏酵母等，从而间接地促进了酱油风味的提升。②乳酸乙酯能使酱油具有良好的香味，而乳酸菌代谢会产生乳酸，酵母菌代谢生成的乙醇会与乳酸反应生成乳酸乙酯。③酱油的咸味会因为乳酸的作用而被隐藏，使酱油味道变得纯正浓厚。相关研究表明，将乳酸菌加在酱油发酵的过程中，可使酱油的色泽有所强化，酱油的红亮度有所提高。

根据相关实验，从高盐稀态酱油的酱醅样品中发现，中后期和中下层的乳酸菌稍微多点。而低盐固态酱油在发酵初期，乳酸菌主要分布在酱醅上层，在中、下层的分布逐渐减少；在发酵中期，中、下层的乳酸菌比较多；在发酵末期，每层的乳酸菌数目达到一个平衡。

1.2 酱油中酵母菌种的分布及其作用

查阅相关文献可知，酱油进行发酵的时候，酵母不仅可以产生各种醇类物质，还可以在代谢过程中生成4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮、4-羟基-2，5二甲基-32-呋喃酮和4-乙基苯酚等物质，因为它们的存在形成了不同的酱油风味，其中酱香的主体香来源于4-乙基苯酚。

实验研究发现，在高盐稀态酱醅中，酵母菌在中层的数量一直比表层多，在发酵前期的数量比后期低很多。而在数量和比例上，酵母菌在低盐固态酱醅中和高盐稀态酱醅中有非常大的区别。此外，在低盐固态发酵中，伴随着上层酱醅中盐分的溶解渗透，其下层酱醅中的盐含量会随时间增大，而酵母的数量却会随时间减少。实验发现，在低盐固态发酵中，由于大多数进行有氧呼吸的酵母的耐盐性较差，在上层酱醅分布较广；在高盐稀态发酵中，酵母菌耐盐性好，因此在酱醅中层分布较广，以便进行无氧呼吸，对厌氧发酵有促进作用，有益于形成酱油中的风味物质。由于对形成酱油风味物质息息相关的酵母大多数是耐盐性酵母，所以，根据酵母菌的分布情况、数目、耐盐性等可以发现，酵母菌群在低盐固态发酵中对酱油风味形成发挥的作用没有在高盐稀态发酵中的作用好。

1.3 酱油中的微生物类群

研究发现，酵母菌以及乳酸菌在高盐稀态酱油中的种类要比低盐固态酱油中的多。在实验中，高盐稀态酱油分离出5种酵母菌，而低盐固态酱油中分离出3种，初步鉴定，其分属为球拟酵母属（Torulopsis spp.）、假丝酵母属（Candida spp.）、酵母菌属（Saccharomyces spp.）、毕赤酵母属（Picia spp.）。同时，乳酸菌在高盐稀态酱油中的种类也高于低盐固态酱油。在高盐稀态发酵中，实验分离出了6种乳酸菌，而在低盐固态中仅仅分离出4种乳酸菌，初步判断为乳杆菌属（Lactobacillus spp.）、片球菌属（Pediococcus spp.）、链球菌属（Streptocccus spp.）、芽孢杆菌属（Bacillus spp.）。但不同的是，分离出的霉菌在低盐固态酱油中比高盐稀态酱油中种类多很多。根据相关的实验数据，在数量上，高盐稀态发酵中的米曲霉（Aspergillusoryzae）有很大的优势，但是霉菌的种类在低盐固态酱油中有很大的优势，不过其中可能有对酱油发酵和风味物质有不利影响的霉菌。

2 多菌种酿造酱油技术

酱油是通过微生物进行发酵从而对淀粉质原料和蛋白质原料进行利用而制成的调剂品。淀粉质原料在发酵中能生成糖和有机酸，并且有机酸能与醇作用生成酯等，蛋白质原料被蛋白酶水解，产生氨基酸及胨、肽等营养物质，而这些生物化学变化过程都必须要有微生物的发酵和微生物生成的酶来进行。蛋白质原料和淀粉质原料在发酵中的转化都极其关键，它们所要利用的多种酶都是从不同种类的微生物中得到。根据我国在酿造酱油中利用微生物的发展情况可以看出：单菌种制曲有其特点，能弥补天然制曲生产中质量不稳定、酶活力小等缺陷，但在酱油风味方面，这种方式酿造出来的并没有多菌种发酵和天然发酵效果好。事实上，多酶系对生产好酱油有很大的关系，而多菌种制曲能生成多酶系，因此多菌种发酵对酱油酿造至关重要。在目前的条件下，多种酶系不可能仅仅来自一种或少数菌种，而是从多菌种中产生。利用多菌种发酵，原料的利用率会大大提高、加工周期也能大大缩短，从而提高了生产效率。

2.1 多菌种制曲

多菌种制曲，是指以米曲霉为主，添加其他菌种协同发酵制曲。混合菌种制曲的主要目的是提高原料利用率和酱油成品香气、色泽等质量标准。2种及以上菌种制曲的原理：酱油进行发酵时，酸性蛋白酶要在偏酸性条件下才能更好地反应。黑曲霉代谢酸性蛋白酶能力较强，在酸性环境下，可以补偿米曲霉分泌的碱性蛋白酶失活的不足。黑曲霉所产的酶类较多，因此黑曲霉在酿造过程中生成的风味成分也比较多，并且对原料蛋白质的分解有促进作用。红曲霉对酱油的色泽有积极作用，可使酱油色泽明艳、气味清香。加入其他菌种的目的是得到更多的酶类，加快原料中蛋白质和淀粉的分解速度，促进风味物质的生成，提高酱油的感官品质。

有研究发现，采用双菌制曲时，米曲霉含量高于95%时会强烈抑制黑曲霉；戴德慧等研究发现，接种量对糖化酶和蛋白酶活力有很大的影响。因此，为了获得更好的协同作用、减少竞争性抑制对各种酶活力的影响，多采用分开制种曲、混合制大曲或者分开制曲、混合发酵的工艺。也有研究采用激活性营养因子解决混菌发酵中多菌株生长不同步的问题。武金霞等用米曲霉的激活性营养因子制成了激活剂，可激发并加速米曲霉的萌发，在双菌种混合制曲时，能使米曲霉和黑曲霉的孢子萌发率更为一致。

2.1.1 米曲霉

米曲霉（Aspergillus oryzae）属于曲霉属菌种，在初期其菌落的颜色多数为黄色或者白色，成熟后为浅绿色和黄绿色。温度在30 ℃左右时，米曲霉生长最快，而低于28 ℃时，其菌体生长慢，高于37 ℃时，会对菌体的代谢和酶的分泌造成负面影响。酱油酿造过程中主要是通过米曲霉代谢分泌出的各种酶的作用进行发酵。在酿造行业，米曲霉是人们研究得最多的菌株之一。米曲霉是被美国公布的安全微生物生产菌株之一。

米曲霉3.042菌株，最初是由上海市酿造科学研究所W中科AS3.863原始菌株，经紫外诱变W及后期的长期驯化得到的优良菌株。米曲霉3.042菌株能生成蛋白酶、淀粉酶等，具有较强的酶活力，常常被应用于酱油酿造中。其蛋白酶系中的碱性蛋白酶和中性蛋白酶活性较高，但是酸性蛋白酶活性不高。各地以米曲霉3.042为出发菌株，采取各种形式进行诱变筛选得到了各具特色的菌株，如天津诱变出的“米曲霉10B1”，广州诱变出了“米曲霉－广州”，傅力等通过紫外线和LiCl复合诱变获1株蛋白酶高产菌株，与出发菌相比，蛋白酶活力提高了33.3%，而且遗传稳定性良好。

与米曲霉混合发酵的菌株大多都具有如下特征：糖化酶活力较高，能和米曲霉酶系互补；能生成许多纤维素酶，然后破坏原料的细胞壁，利用其中的蛋白质与淀粉等原料；产酯化酶，丰富产品的香气；产红色素，增强酱油色泽。常用的混合制曲菌种包括：能产纤维素酶和酯化酶的根霉和木霉；能产许多淀粉酶和纤维素酶的黑曲霉；能产糖化酶、酯化酶和红色素的红曲霉；产纤维素酶的粗壮脉纹胞菌等混合菌种制曲中，由于多种菌种之间存在拮抗作用，需严格控制接种量和菌株配比。

2.1.2 红曲霉

红曲霉（Monascus sp.）最适生长温度为32～35 ℃，最适pH为4.5左右，红曲霉菌落不同就有不同的颜色，主要有淡红色、红色等，同时红曲霉对发酵底物的选择能力很强，多种碳源和氮源可以被红曲霉利用。红曲霉是一种耐酸、耐高温的菌种，它糖化和酯化的能力良好。在酿造行业，红曲霉制成的糖化增香曲已有一定的应用，在1 000年前，中国就开始有相关的红曲霉应用，其中黑色素是红曲霉的衍生物，属于天然色素，红色素能够使pH、温度和氧化还原剂等稳定，洛伐他丁能由红曲霉生成，由于其降脂能力好，因此在医学保健领域有很多相关的研究。姚继承等在酱油酿造的过程中添加糖化增香曲，发现采用红曲霉混合制曲会使酱油中的总氮及氨基酸态氮含量升高，增强酱油色泽、香味、口感等，红曲色素和洛伐他丁是其主要的代谢产物。其中，红曲色素是一种天然的功能性色素，可作为添加剂，应用到食品行业中；洛伐他丁能够抑制胆固醇合成，因此可以作为一种有效的降脂药物。

红曲霉在PDA培养基上的菌落初始呈白色，毛毯状，具褶皱，成熟后菌落呈红色，菌落背面呈红紫色，且培养基被染成红色。Ainsworth分类系统将红曲霉属归于真菌界（eumycetes），真菌门（Eu-mycota），子囊菌亚门（Ascomycotina），不整囊菌纲（Plectomyhcetes），散囊菌目（Eurotiales），红曲科（Monascaceae），红曲霉属（MonascuspurpureusWent）。其中，有8种重要的红曲霉被相关的研究所正式收集编目。

2.1.3 黑曲霉

黑曲霉（Aspergillus niger）也是曲霉属中一种重要的微生物菌株，最适生长温度37 ℃，最适pH 5.0～6.0，属于好氧的菌种，在食品、医药、发酵等行业已经被广泛应用。黑曲霉产酸性蛋白酶的能力很强，在酱油发酵中后期，酸性蛋白酶可以大大提高蛋白质的利用率，提高氨基酸态氮的生成率，同时具有一定的产糖化酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、脂肪酶以及葡萄糖氧化酶等能力，因此在酱油制曲研究中，黑曲霉被越来越多地应用。

Viki等在实验中发现，采用黑曲霉和米曲霉混合发酵，能让原料中的谷氨酞胺酶的含量提高1倍，以此使发酵产品中的谷氨酸含量增高，其含量能增加15%左右。Ishiharn等在实验中发现，采用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能提高酱油发酵产物中的主要形成香味物质的含量，如4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-吠喃酮等。

2.1.4 米根霉

根霉是属于藻状菌门毛霉科的一类菌，它也是我国在酿造行业中常用的一种霉菌，通常使用是米根霉。米根霉在固态发酵过程中可以分泌出丰富的酶系，如淀粉酶、糖化酶、脂肪酶等等。另外，米根霉还能够产生乳酸、柠檬酸以及唬泊酸等有机酸类物质。用米根霉同米曲霉和黑曲霉混合制曲，在酱油发酵过程有利于促进糖类物质的形成，增加酱油中的风味物质以及提高原料蛋白质的转化率，提高了酱油的质量，还可以在一定程度上增强酱油的色泽。

2.2 多菌种发酵

多菌种发酵，一般是指在发酵过程中加入酵母菌和乳酸菌，其中乳酸菌可以使有害微生物的生长受到抑制并产生酯类的前体物，酵母菌会生成许多乙醇和相应的有机酸和酯类，然后能改善产品的感官品质。

多菌种发酵的概念最早是日本科学家在20世纪80年代提出来，有研究发现，在发酵期间加入乳酸菌、鲁氏酵母菌、球拟酵母菌，能明显提高酱油的风味。SUGIYAMA S等对酱油菌种进行了相关的研究，发现Saccharomyces sojae在发酵过程中能生成醇类和醛类等香气以及呈味的琥珀酸等。Candida versatilis发酵过程中能产生极少的4-乙基愈创木酚等物质。耐盐性乳酸菌主要为嗜盐片球菌（Pediococcus halophilus）和四联球菌（Tetracoccus sojae），在30 ℃的条件下产生的乳酸是酱油风味中有机酸的主要来源。虽然乳酸菌、酵母菌能够共同生长，但是若乳酸菌的生长太早，繁殖太旺盛，则会对中性蛋白酶的分解产生消极影响，最终造成酱油的总酸偏大。

2.3 多菌种酿造酱油的优点

2.3.1 利用原料的全氮能力强

采用混合菌种技术酿造出来的酱油，其酱油的原料全氮利用率明显比单一菌种发酵的酱油高。张国春采用沪酿3.042米曲霉单菌种酿造酱油，全氮利用率在72%左右。而将米曲霉和甘薯曲霉等菌种混合发酵，酿造出来的酱油的全氮利用率能增加4%左右。

2.3.2 氨基酸生产率高

判断酱油质量高低的重要指标之一就是氨基酸的生产率，张国春在低盐固态法发酵酱油中，采用多菌种酿制的氨基酸生产率在50.5%左右，比采用米曲霉单菌种酿造的酱油提高了3%左右。

2.3.3 混合培养容易控制

混合菌种的繁殖生长快，菌种生成的物质之间可以互相补充，而且可以防止杂菌污染，故与单一菌种相比，其发酵条件更容易控制。比如，在酱油发酵过程中，淀粉被米曲霉分泌的淀粉分解酶水解得到葡萄糖，然后在第二阶段发酵中，葡萄糖被酵母和细菌利用。在这样的混合培养条件下，尤其是有许多培养物共同生长繁殖，其被污染的可能性极小，就算发生了污染，影响也不大。在混合培养中，微生物区系多数情况下都有很大的优势，乃至培养基可以不消毒。

另外，翟玮玮在研究酱油发酵中发现，把根酶、米曲霉、黑曲霉单独制曲后混合发酵，其蛋白酶活力和原料利用率都大大增大，酱油中总氮和氨基酸态氮的含量有所提高。在酿造成熟期加入乳酸菌和酵母菌，能使酱油的风味有所提高。Plaude等用 Streptococcusthermophilus、Lactobacillus helvet和Bifidobacteriumlongum 3种益生菌纯种接种、混合接种生产酱油，与对照组相比，酱油中大豆异黄酮和B族维生素含量都有所上升。

3 酿造酱油技术在工业生产中的应用

现在，酱油产品的生产技术不再是原来的天然晒露发酵，已发展成现代工业化生产，同时也不再是单一菌种发酵，而是采用混合菌种技术酿造，酱油的酿造工艺也有相应的变化。国内许多学者针对酱油产品生产技术方面的发展情况做了相关总结，并发表了大量与之相关的文献。王夫杰对多酶共同发酵、多菌种共生这一方面，发表了《我国酱油研究现状与发展趋势》一文，对研究酱油风味物质在酿造过程中的形成情况进行了综述，还阐明了将来的研究方向；而成都市调味品研究所的李幼筠从微生物在酱油酿造过程中共同有效利用的角度，发表了《科学利用微生物推动中国酱油工艺大变革》一文，提出了高盐稀态冷温型的酿造工艺。

3.1 二次加工，开发酱油新产品

近年来，将酱油产品进行二次加工在酱油生产行业慢慢地发展起来。在酿造过程中加入合适、适量的食品添加剂来增强酱油产品的色泽、增添其香味；重新对营养组成进行调整，改善产品的感官品质，使酱油的品种变多。例如，用琥珀酸二钠配制的蒸鱼酱油，将盐、黄砂糖等调味料加入普通酿造酱油工艺中得到酱油膏等，增加了我们对酱油口味的选择，使调味品变得丰富起来。有了经济的发展和技术创新的带动，可以相信，二次加工产品将打破酱油终端产品的尴尬场面，让产品多样化。

3.2 生产更加优质的酱油

多菌种酿造酱油为提高产品质量和原料出品率提供了条件，为酿造行业加入了新鲜的技术。很多国内外学者为了改善酱油风味，做了很多与之相关的实验研究。现在的相关技术，除了采用多菌种发酵法，还有几种现代化技术，如固定化细胞技术、膜分离技术、微生物调控技术等，但在实际的生产中应用并不多，大多数采用多菌种发酵法。日本曾想在酱油发酵期间加入相关的酶来改善酱油风味，如KIJIMA K等在实验中将能产γ-谷氨酰胺转肽酶的细菌加在酱醅中来增强酱油的味道。γ-GGT作为催化剂，使γ-谷氨酰化合物水解为氨基酸和多肽。GGT能将Gln转化为Glu，也就是谷氨酰胺酶反应。从酱油中可以分离出一种菌种，它可以生成GGT，然后将其和已失去转肽作用的变异GGT加到酱醅中进行发酵，然后从所得到的产品中测得相关数据，发现谷氨酸含量提高了35%左右，其风味也有所改善。关于酱油生产中酶制剂的运用，我国进行了深入研究。例如，施安辉等在酿造原料蒸煮冷却后加入相关的新型复合酶，使酿造酱油的生产成本和劳动强度大大减少小。

4 结语

采用多菌种酿造技术酿造酱油，在不影响酱油本身感官品质的前提下，根据菌的种类和添加量的不同，其总氮、氨基酸态氮、谷氨酸等物质的含量都会有所增加。从中可以发现，把米曲霉、黑曲霉、红曲霉等菌种在制曲时加入其中，不但可以让酱油中的总氮和氨基酸态氮含量增加，还能提高原料利用率，对酱油风味也有一定的改善。采用多菌种制曲可以降低厂家的生产成本，提高其经济效益，并且多菌种发酵也能摆脱单一菌种酿造酱油的单一风味，丰富酱油的风味，是一个生产高产量、高品质酱油的前进方向。可见，多菌种酿造酱油技术是未来酱油行业发展方向之一。随着酿造技术的现代化技术应用越来越多，我们应在进一步发扬传统酿造优势的同时，利用现代化新技术克服发酵过程中所出现的不足。