西宁市食品中金黄色葡萄球菌污染状况及其肠毒素基因型分布研究

林芳明,张红见,朱艳伟,赵 静

(青海大学农牧学院,青海 西宁 810016)

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引起食物中毒的主要病原菌,也会导致临床感染肺炎及伤口感染。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素(Stphylococcal enterotoxin,SE),按其血清型可分为 A、B、C、D、E 五种主要的基因型,引起从轻微疾病到感染性休克等不同程度的疾病[1-2]。中国在全世界因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第四位[3]。在美国,每年由金黄色葡萄球菌引起食源性疾病发生的病例达24万例,是发生率较高的5种病原菌之一[4]。金黄色葡萄球菌食物中毒事件的不断增加,在全世界引起了广泛的关注[5]。

近几年,国内关于食品中金黄色葡萄球菌的污染状况及其肠毒素基因型的分布研究报道较少,尤其是西宁市食品中金黄色葡萄球菌污染状况和肠毒素基因型的分布状况尚不清楚,为了了解西宁市金黄色葡萄球菌的污染情况以及肠毒素基因在食品中的分布特性,为食品质量安全控制提供指导,笔者于2017年8月-2018年3月对其进行了研究,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 按照食品微生物检验采样的要求,于2017年8月-2018年3月分别从西宁市的集贸市场、大型超市、路边摊点进行样品采集,生鲜牛乳、包装牛乳、蔬菜(茄子、青菜和西兰花)、猪肉和牛肉,共计108份。

1.1.2 质控菌株ATCC 25923 由青海省食品药品检验所提供。

1.1.3 主要仪器设备 电子分析天平、超纯水仪、全自动立式高压灭菌锅、TDZ5-WS多管架自动平衡离心机、LX-100手掌型离心机、SHZ-82回旋式气浴恒温振荡器、水平电泳槽、VORTEX-GENTEZ涡旋振荡器、凝胶成像系统(BIO-PRO 200E)、PCR仪(Bio-Rad)、Autoflex Speed基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(德国布鲁克公司)、MK-20干式恒温器(ALLSHNEG杭州奥盛仪器有限公司)。

1.1.4 主要试剂及培养基 DNA Marker DL-2 000、2xEs Taq Master Mix、PCR回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司产品);pMD-18T、Bacteria DNA Kit提取试剂盒(TaKaRa公司产品);冻干兔血浆、7.5%NaCl肉汤、亚碲磺酸增菌液、Baird-Parker培养基、LB肉汤、营养琼脂基础、血琼脂平板(康为世纪公司产品)。

1.1.5 兔血浆健康兔心脏采血分离血浆。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌的分离 (1)样品处理：样品中加入灭菌生理盐水,混匀,备用;(2)增菌及分离培养：无菌操作取处理过的样品,接至7.5%NaCl肉汤,37℃培养24 h,再转接至Baird-Parker平板,37℃培养24 h,至无杂菌。挑取疑似菌落,斜面保存。

1.2.2 金黄色葡萄球菌的鉴定 (1)革兰染色;(2)溶血试验;(3)血浆凝固酶试验;(4)生化试验。以上鉴定均参照文献[6]试验方法进行。

1.2.3 MALDI-TOF MS鉴定

1.2.3.1 样品制备 采用扩展直接涂抹法流程检测,用无菌枪头挑取新鲜纯菌落,并涂到抛光靶板圆孔上,自然晾干,加1 μL 70%甲酸水溶液,破壁释放蛋白质。之后均匀地加入1 L基质溶液,晾干备用。按照上述操作,向靶上滴加校正标准品。

1.2.3.2 质谱图的采集和分析 用标准品对仪器校准后,应用MALDI Biotyper软件采集并分析样品图谱信息,以Bruker结果作为判定标准,分值与准确度成正比,2.3-3.0分值表示非常可信地鉴定到菌种水平;1.700 0以下表示鉴定结果不可靠。

1.2.4 金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因及肠毒素SE基因的PCR鉴定

1.2.4.1 引物的合成：根据GenBank发布的耐热核酸酶(nuc)基因序列及5种肠毒素A、B、C、D和E基因序列,利用DNAStar软件设计引物(表1),由西安擎科西生物科技有限公司合成。

表1 金黄色葡萄球菌nuc及SE基因引物序列

1.2.4.2 DNA模板提取：根据宝生物细菌基因组提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组。

1.2.4.3 PCR 反 应 体 系(25 μL)：2 × Taq Mix 12.5 μL,引物 F 和 R 各(10 μmol/L)1 μL,DNA 模板1 μL,ddH2O 9.5 μL。 反应程序(nuc、SEA、SEB 和SED)：94℃,5 min(预变性);94℃,40 s,50℃,45 s,72℃,1 min;72℃,10 min;16℃保存(35 Cycle)。

电泳鉴定：将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测耐热核酸酶(nuc)基因和肠毒素SE基因。电泳完成后在凝胶成像系统中观察结果。

1.2.5 金黄色葡萄球菌nuc和SEA、SEB、SED克隆与测序 目的DNA片段回收,连接和转化参照文献[7]试验方法操作。根据蓝白斑筛选原则筛选阳性克隆。送往西安擎科生物科技有限公司测序,测序结果在NCBI上进行Blast比对。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌的分离及生化鉴定 108份食品样品分离出疑似金黄色葡萄球菌60株,疑似菌株在Baird-Parker平板上呈透明圈明显的灰色到黑色菌落(图1A);镜下呈葡萄串状排列的革兰阳性菌(图1B);血平板上呈圆形、光滑、湿润的菌落(图1C)。血浆凝固酶试验呈倾斜离心管不流动的凝固状态(图1D);糖类发酵试验菌液变黄;甲基红试验菌液上层呈红色;接触酶阳性试验有气泡产生(表2)。

图1 金黄色葡萄球菌的鉴定结果

2.2 金黄色葡萄球菌质谱分析结果 通过飞行时间质谱鉴定显示(图2),在60株金黄色葡萄球,除4株金黄色葡萄球菌外,其余56株菌的检出分值均在2.445～2.451之间,表示准确地鉴定到菌种水平。其中质控菌株ATCC 25923的主要特征性质谱峰值为6 892.1。

2.3 金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的PCR鉴定结果 PCR扩增金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因,测序、序列比对,目的条带为279 bp(图3),BLAST验证结果表明,相似度在99%以上。同时,通过PCR对60株金黄色葡萄球菌的五种肠毒素基因型(A、B、C、D、E)进行分型检测,结果扩增出A、B和D三种肠毒素基因型的目的片段(图3),分别为 265 bp、205 bp、509 bp,未检测到 C型和E型,也未检测到同时携带两种肠毒素基因型的菌株。

表2 金黄色葡萄球菌的生化鉴定结果

图2 金黄色葡萄球菌质谱分析结果

2.4 不同种类及来源食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的分布情况 本研究样品共108份,经分离鉴定,其中60份检出金黄色葡萄球菌,检出率为55.56%,猪肉检出率最高,为75%。见表3。

图3 金黄色葡萄球菌nuc及SE基因的PCR结果

表3 样品中金黄色葡萄菌及其肠毒素的分布

同时发现,生鲜牛乳和包装牛乳的的检出率为57.14%、14.28%,这表明适当的包装可以减少金黄色葡萄球菌的污染。肉制品的检出率为牛肉62.5%、猪肉75%,其中牛肉来自大型超市,猪肉来自农贸市场,需引起高度重视。蔬菜(茄子、青菜、西兰花)的检出率为62.5%,这可能与环境条件有关,易受人手和灰尘的污染。

3 讨论

3.1 试验方法对比分析 近几年,MALDI-TOF-MS技术发展迅速,该技术通过细菌蛋白特征图谱鉴定不同微生物。尤其是临床病原微生物的鉴定,国内外都已广泛应用[8-9],与传统微生物方法相比,MALDI-TOF-MS准确性较高,实现了对目标菌株的检出。相对于PCR技术,是一种快速、简便、高通量检测食品中金黄色葡萄球菌和肠毒素基因的方法,同时也通过PCR方法对检出结果进行验证,显示了两种方法良好的一致性。

3.2 不同来源食品中金黄色葡萄球菌的污染情况 本次研究所采集的几类不同样品均分离检测到金黄色葡萄球菌,且阳性率较高,是引起西宁市部分地区食品安全的主要病原菌,说明食品中金黄色葡萄球菌污染较严重。除了来自大型超市的包装牛乳,其余所采样品中金黄色葡萄球菌阳性菌株都很多。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的致病菌,严重影响生鲜乳质量[10]。同时作为主要的食源性致病菌[11],该菌以乳和乳制品为主的食物中毒事件日益增多[12]。样品中的生鲜牛乳主要来源于路边摊,其污染源大多是挤奶之后导致的二次污染,即使灭过菌,牛乳成分中的营养全面,适合金黄色葡萄球菌的生长,加上奶制品本身及其容易受污染,所以很容易在乳中存活。来自农贸市场蔬菜的检出率也很高,和牛肉的检出率62.5%不相上下,这可能是在运输过程中和环境条件的污染有关。此外,生鲜肉适合金黄色葡萄球菌的生长,也易污染金黄色葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌在人居住环境中有很好的适应性,国内的报道中金黄色葡萄球菌的人体带菌率也较高[13]。本次调查结果提示,西宁市食品市场均受到了一定程度污染,肉制品及生鲜牛乳污染尤为严重。所以应该加强各类食品的加工、储藏、运输、销售过程的卫生监管力度,减少食源性疾病导致食物中毒的发生率。同时,适当的包装加工可避免交叉污染,食品包装可调节食品所处的环境进而更好的保存食品[14]。政府部门应通过大量采集样品加强金黄色葡萄球菌的污染监测,做好食品安全的监督工作,控制食源性疾病的发生。

3.3 不同来源食品中肠毒素基因型的分布情况经对5种肠毒素基因型进行鉴定,其中肠毒素B型的检出率最高,为56.67%。然而D型肠毒素的检出率很低,这可能与食品来源和种类有关。其中,肉类中肠毒素B型检出率和蔬菜的检出率一样,为26.67%。从结果看,直接来源于动物体(如猪牛羊)肠毒素B型的检出率和在一些植物性食品(如果蔬)的检出率一样高。所以,蔬菜的监测也不容忽视。关于肠毒素E型检出率的报道,大都是未检出或检出率较低[15]。本研究E型肠毒素未检出。研究表明,在食品的不同样品中分离得到的金黄色葡萄球菌菌株,很多菌株都具有肠毒素活性：德国研究发现,从牛奶中分离的70%金黄色葡萄球菌具有肠毒素基因[16]。傅丹青对食品、公共场所检测样品及食物中毒样品分离的金黄色葡萄球菌菌株进行肠毒素检测,发现肠毒素基因的携带率为47.83%[17]。研究表明,携带肠毒素B型基因的菌株与食物中毒有关[18]。肠毒素B型的检出率最高,表明肠毒素B型与其他4种肠毒素进入细胞的方式不同。对于蔬菜,肉制品中肠毒素的检出率高于蔬菜,农贸市场和路边摊的检出率高于大型超市。因此,食品样品来源和种类不同,其肠毒素基因分布不同,毒素基因型也不同。

4 结论

对西宁市不同来源、不同种类108份食品样品进行金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,共分离出60株,检出率为55.56%;其中,肠毒素基因型检测出42株,检出率为70%。食品的来源和种类不同,污染情况也各异,肠毒素基因型的分布情况也各异。金黄色葡萄球菌污染主要是原料带菌与加工或运输贮存过程的污染;携带不同肠毒素基因型的菌株与其来源有密切关系。