云南独蒜兰组培快繁技术研究

李蕾

摘 要：目的：通过研究云南独蒜兰种子萌发、小苗增殖和生根的适宜培养基，建立一套独蒜兰组织培养的快速繁殖体系。方法：以独蒜兰种子为外植体，研究激素（6-benzylaminopurine和1-naphthlcetic acid） 不同质量浓度配比对云南独蒜兰小苗增殖和壮苗生根的影响。结果：云南独蒜兰小苗增殖最适培养基为 1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L，壮苗与生根最适培养基为 1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L。结论：建立了一套云南独蒜兰组培快繁体系，可用于大规模生产云南独蒜兰组培苗。

关键词：云南独蒜兰；种子；组培快繁

中图分类号 S63 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）01-0010-03

Abstract：Objective To explore suitable culture mediums for the seed germination，seedling multiplication，rooting and growth of plantlet in Pleione yunnanensis，in order to establish a tissue culture and rapid propagation system.Methods Seeds of Pleione yunnanens is were used as the explants，and the effects of different mediums on proliferation，rooting and seedling. Results The most suitable culture medium for proliferation was 1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L，The most suitable culture medium for rooting and seedling was 1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L。Conclusion This research established a tissue culture and rapid propagation system，which could be used for the large scale production of Pleione yunnanensis.

Key words：Pleione yunnanensis；Seed；Tissue culture and rapid propagation

云南獨蒜兰〔Pleione yunnanensis（Rolfe）Rolfe〕，兰科独蒜兰属的一种半附生兰，国内主要产于四川、贵州和云南[1]，假鳞茎为中药山慈菇的主要来源之一。云南独蒜兰为《中国药典》收载品种，具有清热解毒、止咳化痰，止血生肌。主治肺结核，百日咳，气管炎，痈肿，消化道出血，外伤出血等[2]。近年来，由于其含有的秋水仙碱具有抗肿瘤的活性，独蒜兰市场需求量不断增加。但其种子小，自然状态下很难成功萌发及生长，加之野生资源破坏严重，所以通过组织培养是获得大量完整再生植株的重要技术手段，亦是缓解资源环境压力的主要途径。近年来有少量关于独蒜兰组织培养方面的报道，如陈之林等人对白花独蒜兰进行了组培快繁研究，以种子和原球茎为外植体成功获得了组培苗[3]；张燕等人认为，在独蒜兰组培快繁研究中，以种子为外植体生产组培苗是最好的方法[4]。本文就云南独蒜兰组培快繁体系进行了研究，为建立和完善云南独蒜兰的人工繁育技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 外植体：以云南独蒜兰成熟且未开裂的蒴果为外植体，采自云南省文山市。

1.2 实验方法

1.2.1 外植体消毒 用适量洗洁剂先洗涤蒴果6min，然后用无菌水冲净洗洁精，在超净工作台上将洗涤后的蒴果用75%的酒精表面消毒处理2min，再用0.1%的升汞（HgCl2）消毒15min，用无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。

1.2.2 无菌播种 超净工作台上用消毒后的手术刀将消毒处理过的蒴果两端切除，纵向剖开蒴果，将种子播于培养基上，轻轻晃动培养瓶使种子均匀散布。完成接种后将其置于培养室培养，诱导种子萌发阶段避光培养，温度为25℃，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养，温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度1200lx。此阶段培养基为：1/2MS+NAA（1.0mg/L）+炭粉（1g/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH=5.8。

1.2.3 原球茎增殖 在播种40d后极少数原球茎开始分化出叶，同时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物。此时的原球茎经过继代培养，有利于原球茎的增殖，生长速度加快。本阶段采用光照培养，温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1200lx。此阶段以1/2MS+6-BA（1.5mg/L）+NAA（0.5mg/L）+炭粉（1g/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH=5.8为原球茎继代培养、增殖的培养基。

1.2.4 叶芽诱导、丛芽增殖 原球茎经增殖培养20d后大部分原球茎都能长出第1片叶芽，但丛生芽数量相对较少，叶片弱小，此时，需对继代增殖原球茎进行叶芽诱导、丛芽增殖，选用已经设计好的不同激素种类和浓度的培养基进行培养，选择大小适合的原球茎用于接种。采用光照培养，温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度1200lx。经培养40d后，统计丛生芽的数目。此阶段以1/2MS+6-BA（变量）+NAA（变量）+炭粉（1g/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH=5.8为原球茎继代培养、增殖的培养基。

1.2.5 生根壮苗培养 选取经叶芽诱导、丛芽增殖的小苗用于生根壮苗培养研究，设计不同激素种类和浓度进行培养，所选材料要求大小和长度，生长状况一致的小苗。完成接种后将材料移至培养室中，采用光照培养，温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度1200lx。endprint

2 结果与分析

2.1 诱导种子无菌萌发阶段 种子在播于培养基后约24d开始萌发，出现白色类原球茎，然后转至光照培养，白色原球茎逐渐形成黄绿色的原球茎，出现绿色点芽点。原球茎逐渐长大，颜色转绿，在播种40d后极少数开始分化出叶，同时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物。

2.2 叶芽诱导、丛芽增殖阶段 此阶段设计不同激素种类和浓度进行培养。原球茎经过叶芽诱导、丛芽增殖培养30d后，丛芽数目开始增多，多数芽也长成接种前1～4cm不等的小苗，而且基部开始膨大，直径大多达1～2mm。此时进行观察和测量，统计诱导叶芽数目如表1。

对原球茎进行芽诱导是组培中的重要环节，提高叶芽诱导率和丛芽增殖，为获得大量的组培苗奠定基础。为能反应出各处理对独蒜兰原球茎的叶芽诱导、丛芽增殖影响作用的差异，从中选取到最佳激素组合，所以对表1结果进一步作方差分析，见表2。

表2中可以看出，NAA的P=0.019<0.05，6-BA的P=0.177>0.05，表明：在該范围浓度下的NAA和6-BA组合对处理对独蒜兰原球茎的叶芽诱导、丛芽增殖影响作用实验中，对叶芽诱导、丛芽增殖影响的主效应是NAA，而6-BA的影响不显著。在6号处理组NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L中的平均出芽数最多，叶芽诱导、丛芽增殖效果最好。

2.3 生根壮苗培养阶段 此阶段设计不同激素种类和浓度进行培养。50d观察不同处理组，叶片较接种前增长，茎的基部膨大明显，膨大的基部下面长出1～4条根。此时进行观察和测量，统计生根数目、根长，球茎大小及叶片长度，见表3。

在组培中，生根率是重要的指标，为能反应出各处理对云南独蒜兰组培苗生根情况影响作用的差异，从中选取到最佳激素组合，所以对表3结果进一步作方差分析，见表4。

表中4可以看出，NAA的P=0.002<0.05，6-BA的P=0.007<0.05，表明：在该范围浓度下的NAA和6-BA组合对处理对云南独蒜兰组培苗生根率影响作用实验中，不同浓度NAA和6-BA组合对组培苗的生根率影响均达到了显著水平。在9号处理组NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L的平均生根率最高，平均根长度也最长，生根效果相对较好。

3 结论

本实验选取云南独蒜兰经授粉、成熟且未开裂的蒴果内的种子为外植体，诱导种子萌发产生原球茎。在此基础上，对原球茎进行增殖、扩繁，获得后续实验中所需的愈伤组织和不定芽。丛生芽诱导阶段，以1/2 MS为基础培养基，处理组（1/2 MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L）的平均出芽数最多，对叶芽诱导、丛芽增殖效果最好。生根壮苗阶段，以1/2 MS为基础培养基，处理组（1/2 MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L）的平均生根率最高，平均根长度也最长，生根效果最好。

参考文献

[1]陈心启，吉占和.中国兰花全书[M].北京：中国林业出版社，2003.

[2]何顺志，徐文芬.贵州中草药资源研究[M].贵阳：贵州科技出版社，2007.

[3]陈之林，叶秀麟.白花独蒜兰的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2004，40（4）：455.

[4]张燕，黎斌.濒危兰科植物独蒜兰的快速技术研究[J].陕西农业科学，2013（3）：57-59.

（责编：施婷婷）endprint