奥地利发现与仔猪先天性震颤相关的新型瘟病毒（Linda病毒）

摘译自Benjamin Lamp，等， Emerging Infectious Diseases. 2017， 23：1176-1179咸 文，梁海英，曾智勇

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

荐语：仔猪先天性震颤可导致仔猪震颤，无法正常吸吮乳汁，常导致断奶前仔猪死亡率升高，给养猪业造成很大损失，本文介绍了奥地利某猪场暴发仔猪先天性震颤，经检测发现致病因素为一种新型瘟病病毒种类——Linda病毒。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威远人，博士，贵州大学教授、硕士研究生导师、贵州大学学术骨干，贵州省科技特派员，黑龙江畜牧兽医杂志编委。主要从事动物传染病及病原分子生物学相关研究，以规模化猪场主要病毒性疫病为基础，开展新型疫苗和病原快速检测方法及试剂盒的研发。同时，长期面向猪场开展猪病毒性疫病的抗体监测和病原的快速检测以及规模化猪场疾病防控指导，为猪场提供技术支持。

主持国家自然科学基金项目1项，省厅级项目3项；参研贵州省农业科技攻关项目5项，其他各类省厅(局)级项目13项；获“贵州省科学技术进步奖三等奖”3项。先后发表各类学术论文180余篇，其中SCI论文3篇，一级学报论文12篇，核心期刊90余篇；参编养殖技术丛书3册，参编专业类编著2册，参编《畜牧兽医行政管理学》（国家统编教材）。

2003年在澳大利亚某猪场出现猪的非典型瘟病毒，后被称为Bungowannah病毒（BV）， 该病毒引起母猪的繁殖障碍，死胎和猝死，由于其明显的致病性，BV被认为是对全球猪健康事业最大的威胁，但这种病毒或其类似病毒在其他地方从未发现过。最近，一组新型的猪瘟病毒在北美被鉴定，称之为非典型猪瘟病毒（APPV），随后在欧洲也检测到该病毒。有充足的证据表明，APPV是仔猪A-II型先天性震颤（CT A-II）综合征的致病因子，其特征表现为因脑和脊髓中不同程度的低髓鞘化而引起的全身性震颤。然而，边界病病毒（BDV），牛病毒性腹泻病毒（BVDV）或猪瘟病毒（CSFV）在妊娠晚期感染后，也可导致羊、牛或猪的胎儿脑中出现类似的低髓鞘化。奥地利某农场于2015年1月份暴发了仔猪先天性震颤（CT），造成大量损失，仔猪表现严重地横向震动，常常无法吸吮乳汁，导致断奶前死亡率升高；CT的发病率从20%到100%不等。该场发生CT疫情后，PSY由原来的25.8降低到仅22.4；病理检查后证实存在典型的CT A-II病理损伤。

然而，利用基于RT-PCR的APPV特异性TaqMan探针，检测来自该场的不同样品，其结果均为阴性。但是应用新的瘟病毒属通用引物（PPF 5'-GTKATHCAATACCCTGARGC-3'和PPR 5'-GGRTTCCAGGARTACATCA-3'），通过RTPCR从CT仔猪血清样品扩增，获得了一定长度的扩增产物，该通用引物也能够用于检测CSFV，BVDV-1，BVDV-2，BDV，BV和APPV。该扩增产物测序结果显示，是一段具有连续性开放阅读框的未知序列，核苷酸BLAST比对结果显示未见有相似性序列，但翻译后的270aa序列却与不同的瘟病毒相关序列排序一致。在CT仔猪及其同窝仔猪的所有样本（血清，扁桃体，肺，肝，脾和中枢神经系统材料）中均检测到病毒RNA。

将CT仔猪血清样品接种SK-6细胞后，采用RT-PCR能检测到未知瘟病毒的核酸。为避免与其他瘟病毒混淆，暂时将该致病因子其命名为“Linda”（诱导神经组织损伤导致横向震颤的致病因子），利用标准引物进行RT-PCR扩增获得了Linda病毒（LV）的全基因组，并上传至GenBank（登录号KY436034），其长度为12 614 bp，具有381 bp的5'-非翻译区，11 772 bp的开放阅读框和461 bp的3'-非翻译区。利用CLC Workbench 7.6对LV进行系统发育分析，发现LV与APPV之间的相似性仅有60%，与BV之间的相似性为68%。LV与BV氨基酸序列相似性为69%，与其他瘟病毒的氨基酸相似性＜54%。LV中含有所有已知的NS3蛋白酶裂解位点；位于典型猪瘟病毒的L/A、BV的L/S位点上的NS4A-NS4B裂解位点，在LV中被定位于L2354/S2355位点处；在LV中，分子内NS3切割位点（L1834/A1835）系保守位点，每种推导的成熟蛋白与BV成熟蛋白匹的配度最好。将Linda病毒（GenBank登录号KY436034）的核苷酸（图1）和氨基酸（图2）序列分别进行遗传进化树分析，其均与Bungowannah病毒（登录号EF100713.2）处在同一进化分支上，同源性较近。而标准瘟病毒BVDV-1（登录号M31182.1）、BVDV-2（登录号U18059.1）和BVDV-3（登录号AB871953.1）处于同一进化分支；CSFV（登录号X87939.1）和绵羊瘟病毒（登录号：NC_018713.1）处在同一进化分支上；BDV（登录号AF037405.1 ）和驯鹿瘟病毒（登录号AF144618.2）则位于同一进化分支上，上述三个分支共属于一个较大分支，与LV病毒所属分支较远，同源性也较远。

图1 核苷酸遗传进化树分析

被称为6A5的BVDV E2特异性抗体对LV感染细胞有很强的反应性。在Western印迹分析中，该抗体可与LV的E1-E2异二聚体（75kDa）以及E2单体（50kDa）反应，但与BVDV-1 E2的反应性更强。利用该抗体，可在体外对LV的增殖进行很好的研究。SK-6 和MDBK细胞在被接种LV后，LV E2抗原信号可在其细胞质中被检测到，但在SK-6细胞中的E2抗原阳性病灶比MDBK细胞大10倍。在接种的猪原代细胞悬液中，LV感染滴度可大于107TCID50。利用单克隆抗体6A5进行免疫组化分析，可在患CT仔猪的组织学病变区域中检测到阳性抗原。三叉神经核、小脑神经胶质细胞和脑白质、肾脏肾小管上皮的神经元特异性染色结果证明瘟病毒可以穿过血脑屏障。但是在胎儿发育过程中，瘟病毒诱导鞘内脱髓鞘的机制仍不清楚。

图2 氨基酸遗传进化分析

通过在CT仔猪脊髓的整个白质中观察到严重的鞘内脱髓鞘病变，在脑中检测到瘟病毒抗原，表明瘟病毒感染和病变之间存在因果关系。与几乎不感染培养细胞的APPV相比，LV与BV类似，可以很容易地在猪细胞系上增殖而不需要适应过程，因而认为LV可能与BV有共同的祖先。大约10年前，BV就在全球范围内得到了广泛的关注，但目前在澳大利亚境外从未被发现过。由于BV广泛的细胞嗜性，进而提出了关于该病毒系跨种感染猪的假说。E2特异性单克隆抗体6A5的交叉反应鉴别实验结果表明，其与各瘟病毒的蛋白存在交叉反应性，这可能会干扰CSFV的血清学检测。LV在欧洲的流行病学情况，其对实验动物的毒力评估，仍需要进一步的调查和研究。