猪瘟、猪蓝耳病毒和沙门氏菌混合感染的实验室诊断

于国伟，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种具有高度接触性，急性，热性，多数呈地方流行性的传染病[1]。主要表现为仔猪呼吸困难、气喘等呼吸系统症状和高致死率，主要传播途径为空气和接触等水平传播，也可通过胎盘和交配等垂直传播。猪瘟(CSF)又称猪霍乱或烂肠瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性、急性或慢性、发热性和致死性传染病。其主要临床表现为母猪发生繁殖障碍性疾病，不孕不育，流产，死胎等症状。该病不仅引起母猪繁殖障碍、新生仔猪先天感染以至死亡，还可引起免疫耐受并出现免疫失败的现象。目前，该病在包括中国在内的亚洲、非洲、拉丁美洲、欧洲东部等的养猪国家和地区都有不同程度的发生与流行，给养猪业的繁育和经济带来了严重损害[2，3]。猪沙门氏菌病(swine salmonellosis)又名仔猪副伤寒(Piglet paratyphoid)，是由沙门氏菌属细菌引起的仔猪的一种传染病，主要表现为败血症和坏死性肠炎，有时发生脑炎、脑膜炎、卡他性或干酪性肺炎[4]。该病在临床上分为急性和慢性两型，一般呈散发或地方性流行，一年四季均可发生，但以春、冬和潮湿多雨的秋季发生居多。2017年8月，实验室接诊大庆市某猪场送检病例，经实验室诊断确诊为猪瘟、猪蓝耳病毒和沙门氏菌的混合感染。现报告如下：

1 发病情况

黑龙江省大庆市某猪场存栏300头猪，2017年8月该猪场仔猪突然发病，临床表现为发热，体温升高至41～42 ℃，仔猪腹泻排有黄色或灰绿色稀便，呼吸困难，偶有气喘，体表皮肤发绀并有针状出血点，精神萎靡，食欲废绝，仔猪发病率约为45%，死亡率约为55%，病程为2～5 d。母猪食欲下降，精神沉郁，个别出现流产与死胎等症状。

2 剖检变化

眼观，病猪全身皮肤发绀，腹部及臀部发紫，耳尖发紫，眼结膜水肿，腿部和背部有针尖大小出血点，被毛粗乱无光泽，腹部有不规则的隆起丘疹。剖检后，取出腹股沟淋巴结发现其肿大并充血，肠壁增厚充血并有溃疡灶，肠系膜淋巴结肿大充血（见图1），腹腔里肝脏水肿，脾脏肿大表面有出血点并伴有少量坏死灶（见图2），回盲口处有扣状肿。胸腔中肺脏明显水肿且严重充血，肺膈叶有轻度卡他性炎症（见图3），通过流行病学调查、临床症状和病理剖检脏器变化初步怀疑为猪瘟、猪蓝耳病毒和沙门氏菌混合感染，但还需进一步通过实验室诊断来确诊。

图1 肠壁增厚充血，肠系膜淋结肿大

图2 脾脏水肿且有白色坏死灶

图3 肺脏肿大充血

3 实验室诊断

3.1 细菌学检测

无菌采集病死猪的肠、肺脏用平板划线法涂布于琼脂培养基中，37 ℃培养24 h，形成灰白色菌落，挑取菌落于SS琼脂培养基中，37 ℃培养24 h，观察到中间黑色外部透明的圆形菌落（见图4），挑取其菌落进行革兰氏染色，镜检时可见两端钝圆的阴性杆菌（见图5）。

图4 SS琼脂培养基上长出中间黑色外周透明的菌落

图5 两端钝圆的阴性杆菌（10x10）

3.2 生化鉴定

细菌纯培养后，分别接种于硫化氢、苯丙氨酸、鸟氨酸、甲基红、尿素、赖氨酸、枸椽酸盐、靛基质、葡萄糖等生化培养基，37 ℃培养24 h，观察其生化反应特性，结果为该菌株可使硫化氢变黑，能分解葡萄糖但产酸不产气，能使鸟氨酸和赖氨酸变紫但不能发酵尿素，符合《常见细菌系统鉴定手册》中沙门氏菌的特征，因此可判定该菌株为沙门氏菌（见表1）。

3.3 药敏试验

挑取单菌落溶于生理盐水中，然后均匀涂布于血琼脂培养基中，贴上四环素、恩诺沙星、头孢唑啉、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、林可霉素等药敏片，37 ℃培养24 h，通过测量抑菌环判断其耐药性，结果表明该细菌对恩诺沙星、庆大霉素和链霉素高度敏感；对卡那霉素、克林霉素中度敏感；对四环素、头孢唑啉和林可霉素有较强的耐药性（见表2）。

3.4 PCR检测

用TIANamp Virus DNA/RNA Kit 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取病料组织的DNA和RNA，用猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病毒、猪链球菌、猪沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒等特异性引物进行PCR扩增检测，这些特异性引物参照GenBank公布的基因序列进行设计而合成（见表3）。结果显示第1泳道在599 bp左右处有一条条带，与猪瘟病毒引物的目的片段大小相符；第2泳道在372 bp左右处有一条条带，与猪蓝耳病毒引物的目的片段大小相符；在第3泳道307 bp左右处有一条条带，与猪沙门氏菌引物的目的片段相一致（见图6）。再结合该病例的发病情况、临床表现、剖检后组织器官的病理变化以及相应的实验室诊断可确诊为该病例是由猪蓝耳病毒、猪瘟和猪沙门氏菌的混合感染。

图6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

表1 生化鉴定结果

表2 药敏试验结果

表3 引物列表

4 讨论

结合发病情况、剖检后组织器官的病理变化、临床表现以及实验室诊断等方面可确诊大庆市某猪场送检的病猪为猪蓝耳、猪瘟病毒和猪沙门氏菌的混合感染。虽然该猪场已经免疫接种过猪瘟及猪蓝耳病疫苗，但体内产生的抗体不足以抵抗病毒的侵袭，恰好大庆地区在8月初频繁下雨导致空气环境闷热潮湿，在这种应激条件的刺激下很容易使猪群发生应激反应，致使其免疫抵抗力降低从而继发感染沙门氏菌。因此，应尽量改善猪群的生活环境，并制定合理的免疫程序，避免引起猪群细菌性继发感染。

1）目前，猪蓝耳病毒和猪瘟病毒尚无特效药可供治疗，因此预防是关键。防治原则是尽力切断或减少传染源并提高敏感动物的抗病能力，防止并发和继发感染；严格控制生猪来源，避免外毒带入；坚持自繁自养。加强饲养管理， 搞好猪圈的清洁卫生；减少饲养密度，保持良好通风，做到冬暖夏凉；调整日粮，多添加富含维生素、矿物质的饲料，以保持氨基酸平衡[5]。同时，该猪场可采取全进全出方式，尽量避免不同猪群间的接触在最大程度上降低感染。

2）目前，防治猪沙门氏菌病的疫苗种类较多，但最好使用当地或者本群分离得到的菌株制成的单价灭活疫苗，具有最好的免疫效果，而一般的单价灭活苗和多价灭活疫苗效果较差[6]。本实验室通过药敏试验确定了庆大霉素、链霉素、恩诺沙星对该株沙门氏菌具有良好的灭菌抑制作用，建议采用以上药物治疗猪群。

3）定期用消毒水对猪场进行喷雾消毒，降低环境中的细菌量。对病死猪要严格执行无害化处理，而对病猪的排泄物及污染的饲料、饮水、用具、食槽和圈舍等，要用2%～4%火碱溶液或10%～20%石灰乳进行彻底消毒[7]。同时对运输车辆也要做好消毒工作，防止外来病毒入侵。

[1] BILODEAU R， ARCHAMBAULT D，VEZINA S A， et al. Persistence of porcine reproduetive and respiratory syndrome virus in fection in a swine operation[J]. Can J Vet Res，1994，58(4)： 291-298.

[2] PEREDA A J，GREISER- WILKE I，SCHMITT B， et al. Phylogenetic analysis of classical swine fever virus(CSFV)field isolates from outbreaks in South and central America [J]. Virus Res， 2005， 110(1/2)： 111- 118.

[3] WU C M，HSUAN S L，CHEN Z W，et， al. Expression and immunological studius of classical swine fever virus glycoprotein E2 in the bi-cistronic baculovirus/larvae expression system[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010， 74(7)： 1343- 1349.

[4] Marzia Mancin， Lisa Barco， Cristina Saccardin， et al. Proposed statistical analysis to evaluate qualitative proficiency testing of Salmonella serotyping[J]. Accreditation and Quality Assurance， 2015， 20(4)： 305-310.

[5] 吴彩霞， 李和平. 猪蓝耳病的综合诊断与防治新技术研究进展[J]. 青海畜牧兽医杂志， 2015， 45(2)：54-55.

[6] 张娜. 猪沙门氏菌病的流行病学、临床表现、诊断和防控[J]. 现代畜牧科技，2017 (4)：86.

[7] 周秀芹. 猪沙门氏菌病的诊断与防控措施[J]. 国外畜牧学(猪与禽)， 2016，36(9)： 84-85.