肉牛妊娠初期血、尿中孕酮、妊娠相关糖蛋白、早孕因子的变化

金 海， 赵拴平， 徐 磊， 贾玉立， 贾玉堂*

(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省颍上牛哥牧业科技有限公司，安徽 颍上 236200)

肉牛饲养中，配后未孕确诊的时间越早，越有利于缩短配种间隔，减少空怀时间，提高牛群受胎率，降低饲养成本。而母牛体内相关生殖激素及水平能反映出自身妊娠状态，比如孕激素，主要成分为孕酮(P4)，与雌激素共同调节雌性动物发情与妊娠，动物妊娠后P4一直维持在较高水平。妊娠相关糖蛋白(PAG)是反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在母体子宫上皮细胞融合时释放的物质，检测血液中PAG逐渐成为国际主流的牛早期妊娠诊断方法[1]。早孕因子(EPF)是由Morton等在小鼠受精6 h后的血清中首次发现，此后在妊娠猪、牛、羊等哺乳动物母体内均有发现，是确认妊娠的标志之一[2]。近年来，研究配后母体内激素含量变化是一种新颖、前沿的早期妊娠诊断技术，奶牛[3]、牦牛[4]、水牛[5]、羊[6]、熊猫[7]、猕猴[8]等动物上均有报道，但目前仍处于研究阶段，未见成熟上市产品及推广。激素的种类及判定标准也在不断完善和丰富。

试验通过酶联免疫检测(ELISA)试剂盒检测肉牛配种后的不同天数中，血液、尿液中P4、PAG和EPF浓度变化，用于对比母牛妊娠与非妊娠、血液与尿液中的差异，为今后尿液作为早期妊娠诊断媒介的可能性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验样本选择及分组

选择颍上牛哥牧业科技有限公司大别山资源场内的安—大杂交牛F1代(安格斯♂×大别山♀)作为试验牛，随机选择膘情适中，繁殖机能正常，发情明显的F1代7头。圈养在同一栏(栏面积约80 cm2)，一天两餐，饮水充足，每天清扫1次栏舍。每头牛喂青贮饲料20～30 kg/d，精料2～3 kg/d。

爬跨或接受爬跨，且阴道有粘液流出的母牛视为发情。7头试验牛发情表现均明显，其中5头配种后均未返情，视为怀孕(试验组);另外2头在配种后21 d返情，视为未孕(对照组)。

1.2 采样及样品处理

牛发情并配种的当天记为第0天，在第0、1、8、17、21、28、35 天(共7次)分别采集血、尿液各5 mL。绑定架固定好牛后，采用红头真空采血管(不添加任何添加剂)颈静脉采血，等牛排尿时，直接用10 mL离心管收集尿液。

采集的血液4 ℃静置1 h，离心机3 000 r/min离心30 min，收集血清，分装标号。处理后的血样、尿样-20 ℃冷冻保存。

1.3 激素检测

用ELISA试剂盒检测试验组与对照组在不同时间内血、尿中激素(P4、PAG、EPF)的含量变化，ELISA试剂盒购买于江苏酶标生物科技有限公司。按照试剂盒说明书操作。

1.4 数据统计分析

采用SPSS Statistics 17.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析，LSD法进行多重比较。以P<0.05为差异显著，0.05

2 结果与分析

2.1 妊娠初期血、尿中孕酮(P4)浓度变化

由表1可知，0～35 d，试验组与对照组血、尿液中P4浓度无明显变化。同一组别中，血液浓度高于尿液的。同一样品中，试验组浓度高于对照组。试验组血液中P4含量与对照组在第0/17/21/35天差异显著(P<0.05)，在第8天差异极显著(P<0.01)。试验组尿液中P4含量与对照组在第1天，差异显著(P<0.05)，在第5天差异极显著(P<0.01)。

2.2 妊娠初期血、尿中妊娠相关糖蛋白(PAG)浓度变化

由表2可知，0～35 d，试验组与对照组血、尿液中PAG浓度变化平稳。同一样品中，对照组浓度高于试验组。同一组别中，血液中的浓度高于尿液。试验组与对照组血、尿液中，PAG浓度均先升高后下降。血液中，第8～17天浓度较高，随后下降。尿液中，第8天达到小高峰，随后浓度下降，第28天后又逐渐上升。血液中PAG浓度，对照组与试验组在第8/21天差异显著(P<0.05)，第28天极显著(P<0.01)；尿液中PAG浓度，对照组与试验组在第21/28天差异显著(P<0.05)。

表1 妊娠初期血液与尿液中P4检测结果 pmol/L

注：*表示对照组与试验组差异显著(P<0.05)；**表示对照组与试验组差异极显著(P<0.01)。下同。

表2 妊娠初期血液与尿液中PAG检测结果 ng/L

2.3 妊娠初期血、尿中早孕因子(EPF)浓度

由表3可知，母牛配后0～35 d里，血液、尿液中EPF浓度变化平稳。但试验组浓度高于对照组，血液中的高于尿液。比较同一天里的试验组与对照组浓度差异可知，血液中试验组与对照组浓度差异值较大，在第8/17/21天，有显著差异(P<0.05)。尿液则浓度差异值较小，在第28天，有显著差异(P<0.05)。

表3 妊娠初期血液与尿液中牛EPF检测结果 ng/L

4 讨 论

4.1 P4作为牛妊娠诊断的依据

理论上认为，母牛在发情至配后第5天前，P4浓度较低且无明显升高，自此之后明显增长，直到第16天左右，体内P4会逐渐增加，若妊娠，则维持在较高水平，安宫保胎。有研究表明，湘西黄牛发情当天血液中P4浓度(0.36 ng/mL)较低，第12天达到峰值(14.85 ng/mL)[9]。草原红牛、延边黄牛、西门塔尔在发情当天和配种后1 d内，血清中P4含量(约1 ng/mL左右)很低，第8天含量升高，直至第17天，孕牛与非孕牛P4含量出现显著性差异，孕牛持续维持在较高水平，非孕牛则开始下降。3个品种配后第21天的P4含量，以孕牛均高于未孕牛，差异极显著[10]。而本次试验中，无论是试验组与对照组，还是血液与尿液中，整个妊娠初期P4均没有出现明显的高低浓度波动，甚至血液试验组在第8～21天含量呈下降趋势。具体原因有待进一步研究。

4.2 PAG作为牛妊娠诊断的依据

PAG是反刍动物胎盘滋养层细胞分泌产生的一类特异性糖蛋白，是反刍动物独有的糖蛋白[11]。Zoli等[12]利用放射免疫技术(RIA)测定妊娠母牛血液中PAG浓度变化，结果发现PAG浓度在妊娠20～240 d持续增长，产后PAG浓度逐渐降低。近年来，牛PAG研究主要集中在配种26 d以后，其原因在于胎盘糖蛋白在妊娠诊断中的应用只有在怀孕后26～30 d才能产生高敏感性和特异性[13]。可能现有的检测技术精确度仍有所欠缺，在低浓度条件下，敏感性、稳定性、可重复性不够，难以发现和总结母牛配后26 d前的PAG规律性变化。本试验检测配后0/1/8/17/21/18/35 d的PAG浓度，是为了研究配后0～35 d PAG浓度合理变化规律，虽然对照组与试验组浓度有差异，但变化趋势相似，即妊娠与未妊娠母牛PAG变化相似，与理论规律有所出入，这尚需进一步考证。

4.3 EPF作为牛妊娠诊断的依据

EPF优势在于无种属差异[14]，制备检测试剂盒的材料来源广。有研究表明，奶牛受精24 h后，血清和乳中可检测到EPF，妊娠终止，则会在48 h内消失[15]。也就是说，体内EPF的存在可以作为妊娠的标志物，也可以作为早期妊娠诊断的重要指标[16]，但目前围绕EPF开展的早期妊娠诊断研究报道较少。本次试验中，试验组浓度高于对照组，且血液中差异更为明显，在第8天就有明显差异(P<0.05)，而尿液中需要到第28天才有明显差异(P<0.05)，说明相同条件下，怀孕母牛的EPF浓度高于未孕的，且通过血液检测EPF诊断是否妊娠，差异更显著，效果更好。

4.4 牛早期妊娠诊断现状及展望

反刍动物中，奶牛早期妊娠诊断的研究较多。常见的诊断方法有直肠检查、超声波B超检查等临床诊断和监测激素变化的实验室诊断[17]。临床诊断方法对操作技术、检测设备要求高，过程繁琐，熟练的从业者最早只能在配后第35天确诊牛的妊娠;此外，触诊可能会导致胚胎或胎儿意外死亡[18]。实验室诊断则相对简单和安全，最初采用放射免疫方法检测早期妊娠母牛体内激素变化，但昂贵的检测设备和辐射危害，限制了实际生产中的使用和推广。近年来，随着酶联免疫吸附技术(ELISA)的快速发展，其更为简洁、方便、快速的操作，在早期妊娠诊断领域里也有了更多的使用和研究。被诊断的动物从常见的奶牛，推广到黄牛、羊、猴、大熊猫、黑熊等不同物种上。

检测样品呈现多元化，包括乳汁、血液、尿液、阴道粘液、粪等。其中，笔者认为，尿液是反映机体激素变化一种良好的媒介。优势在于，采集方便，不仅是在体内激素变化的辅助诊断上具有重要价值[19]，而且适用于所有种属动物，可以做到真正的无创[20]。对于肉牛来说，采集奶样不方便，采血应激大，散养牛群绑定、固定操作难度大。以尿液作为妊娠诊断参考的研究也见于报道，蔡正华等[21]将妊娠母猪尿中雌酮水平作为妊娠诊断的依据，王宏娟等[10]用放免方法检测孕牛尿液中生殖激素的变化规律，K.L. Evans等[22]用尿雌酮共轭分析法诊断马的妊娠，J.Volkery等[23]试验结论得出，妊娠羊驼尿中孕酮含量显著高于非妊娠的，适合作为妊娠诊断的标准。

激素检测方法上，主要分为放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫测定法(ELISA)，后者简单快速，更适合于实际生产。大部分早期妊娠诊断研究采用RIA，此方法对检测设备的要求高，有辐射，使用范围受限，不适合集约化、规模化养殖场自行使用。自2010年后，ELISA试剂盒检测激素变化的研究报道有所增加，A. Karen等[24]检测孕牛血清PAG的浓度变化，以配种后第28天直肠检测结果为标准，验证了RIA法与ELISA法的检测结果无差异，证明了ELISA检测的可靠性和可行性。

综上所述，肉牛的早期妊娠诊断研究少，且现有研究主要是通过血液中激素变化诊断鉴定，检测手段主要是RIA。因此，本试验探讨的3个问题，对于肉牛的早期妊娠，第一，体内的妊娠相关激素(P4、PAG、EPF)变化规律；第二，血液，尤其是尿液中的激素变化；第三，国产ELISA试剂盒检测效果。为肉牛以尿液为检测媒介的早期妊娠诊断研究提供了基础工作依据。

5 结 论

肉牛母体内P4、PAG、EPF浓度，血液中高于尿液中。通过ELISA检测肉牛血液中EPF，能在配后第8天诊断母牛妊娠状态。