外源性趋化因子CXC配体12对Hela宫颈癌细胞增殖作用及机制

李 玥 齐亚灵 杨 哲 张泽宇 向 雨 贾琳琳 王伟群

(佳木斯市大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154002)

宫颈癌(UCC)发病率居于女性生殖系统恶性肿瘤的第一位，此外，在女性全部恶性肿瘤中，UCC也仅次于乳腺癌，高居第二位〔1〕。随着经济水平的提升和妇女卫生保健制度的相对完善，UCC的5～10年存活率在不断提高，然而其发病率却呈现逐年上升的趋势〔2〕。研究显示，在多种恶性肿瘤的发生与发展中，炎症反应具有不可低估的作用，其已被提升到癌症发生的第七大要素〔3〕。作为细胞因子超家族成员，趋化因子是分泌性的小分子多肽(8～10 kD)，在免疫和炎症反应中可控制白细胞黏附和跨内皮迁移，在趋化聚集、刺激血管生成的调节中发挥着重要作用〔4〕。本研究探讨外源性趋化因子CXC配体(L)12对UCC Hela细胞增殖作用及其机制。

1 材料与方法

1.1细胞及主要材料 试剂Hela细胞(中科院上海细胞库)；RPMI1640培养基(美国 HyClone 公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；青链霉素(碧云天生物技术公司)；胰蛋白酶、细胞计数试剂盒(CCK)8(武汉博士德生物工程有限公司)；细胞外调节蛋白激酶(ERK)抗体(美国Affinity公司)；二氧化碳培养箱(北京金西盟仪器有限公司)；超级洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；重组人 CXCL12(美国PeproTech公司)。

1.2CCK8检测UCC Hela细胞的增殖 将对数生长期的Hela细胞重悬于含10%FBS和100 μg/ml青链霉素的RPMI1640完全培养基中；将细胞接种于96孔板中(1.5×103/孔)，孔板置于饱和湿度为5% CO2的37℃培养箱中培养 24 h；待细胞完全贴壁后，弃去上层培养基将细胞培养在含10% FBS和不同浓度外源性重组CXCL12(0、10、20、40 ng/ml)的100 μl 的RPMI1640培养基中；分别在培养24、48和72 h后，用CCK8试剂盒检测UCC Hela细胞增殖的情况。

1.3蛋白免疫印迹法检测ERK表达量 将Hela细胞培养于10 cm培养皿中，待细胞汇合度达到85%以上后，收集其细胞沉淀，按比例加入甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白裂解液充分裂解细胞，待测量各样本浓度后，取50 μg总蛋白加入到12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样孔中，90 V电压使溴酚蓝电泳至浓缩胶与分离胶交界处，然后改为110 V电压使溴酚蓝电泳至凝胶底部；利用转移槽使蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(300 mA，2 h)；5%的脱脂奶粉室温封闭3 h，磷酸盐吐温缓冲液(PBS-T)洗膜3×5 min； 加入一抗4℃孵育过夜，PBS-T洗膜3×5 min；加入二抗37℃作用45 min，PBS-T洗膜4×15 min；用电化学发光(ECL)显影液作用PVDF膜，并用全自动化学发光仪曝光、拍照。

1.4统计分析 应用SPSS22.0统计软件进行q检验。

2 结 果

2.1外源性CXCL12促进UCC Hela细胞增殖 培养48 h，浓度40 ng/ml的外源性CXCL12对Hela细胞增殖作用明显高于0 ng/ml(P<0.05)；培养72 h，浓度20 ng/ml的外源性CXCL12对Hela细胞增殖作用明显高于0 ng/ml(P<0.05)，且浓度40 ng/ml时尤其明显(P<0.01)。见表1。

2.2外源性CXCL12上调Hela细胞ERK表达 0、20和40 ng/ml CXCL12 ERK相对表达量分别为0.743±0.068、0.978±0.174和0.994±0.150。与0 ng/ml CXCL12比较，20和40 ng/ml CXCL12均明显上调Hela细胞ERK表达(均P<0.05)。见图1。

表1 不同培养时间外源性CXCL12促进Hela细胞增殖

与0 ng/ml比较：1)P<0.05；2)P<0.01

图1 不同浓度外源性CXCL12上调Hela细胞ERK水平

3 讨 论

全球每年约有52万UCC新增病例，而每年新增病例死亡率大于50%〔5〕。我国成为UCC的高发区，每年约有30%的新增病例和死亡病例发生〔6〕。CXCL12是一种可以由卵巢癌细胞、胰腺癌细胞及腹膜间皮细胞等多种腹腔肿瘤细胞分泌的趋化因子〔7〕。Scotton等〔8〕发现CXCL12在卵巢癌细胞中发挥多种作用，其中重要一点是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促进卵巢癌细胞增殖。ERK是MAPK信号转导通路上一个重要细胞外调节蛋白，包括ERK1和ERK2，能够将信号从表面受体传导至细胞核。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导EST域蛋白(Elk)-1、活化转录因子(ATF)、活化蛋白(Ap)-1、原癌基因c-fos和c-Jun转录活化，参与细胞增殖、分化、维持细胞形态、构建细胞骨架、细胞凋亡和细胞癌变等多种生物学效应〔7〕。本实验结果表明，提高CXCL12表达量可以显著促进ERK表达，CXCL12可以通过上调ERK表达量来促进Hela细胞增殖。

1杨琳琳，王 薇，张红平，等.宫颈癌患者治疗前检测外周血细胞角蛋白19mRNA和鳞状细胞癌抗原的临床意义〔J〕.中国老年学杂志，2017;37(8):1940-1.

2Quinn MA，Benedet JL，Odicino F，etal.Carcinoma of the Cervix Uteri〔J〕.Int J Gynaecol Obstet，2006;95(1):S43-S103.

3Mantovani A.Cancer:inflaming metastasis〔J〕.Nature，2009;457(7225):36-7.

4Jang TL，Schaeffer AJ.The role of cytokines in prostatitis〔J〕.World J Urol，2003;21(2):95-9.

5Koh WJ，Greer BE，Abu-Rustum NR，etal.Cervical cancer，version 2.2015〔J〕.J Natl Compr Canc Netw，2015;13(4):395-404.

6江恩利，谭寒星，冉光伟，等.老年宫颈癌组织中人类白细胞抗原-蛋白的表达及与临床病理特征的关系〔J〕.中国老年学杂志，2017;37(15):3779-81.

7马莲环，刘 建.ERK1/2的研究进展〔J〕.临床与病理杂志，2005;25(3):279-82.

8Scotton CJ，Wilson JL，Scott K，etal.Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2002;62(20):5930-8.