甘草甜素对人食管癌细胞ECA109的影响及机制

梁 岚 张 洁

(攀枝花学院医学院基础整合医学教研室，四川 攀枝花 617000)

我国食管癌的发病率及死亡率高居世界首位。由于食管癌患者的早期临床症状轻微不明显，导致大部分患者因进行性吞咽困难等典型症状就医时已经丧失手术治疗的机会。而化疗则成为了临床上治疗食管癌的重要方法。但其治疗效果往往不理想，患者预后较差。甘草甜素是从甘草中分离提取的三萜类成分〔1，2〕，对多种恶性肿瘤，如肝癌〔3〕、乳腺癌〔4〕等有抗肿瘤的活性，但是还未见甘草甜素在食管癌中的报道。本研究观察不同浓度甘草甜素对食管癌细胞株(ECA109)的增殖、凋亡及周期的影响，并在分子水平上对可能的作用机制进行了探讨。

1 材料与方法

1.1材料 人食管癌细胞株ECA109由中国科学院上海生命科学院细胞所提供。甘草甜素(MDL 号：MFCD00065194，经HPLC测定，纯度≥99.6%)；兔抗bcl-2单克隆抗体、鼠抗bax单克隆抗体、兔抗p53单克隆抗体、兔抗GAPDH(美国Santa公司)；辣根酶过氧化物标记的二抗购自美国Santa Cruz公司，Trizol Reagent购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒和cDNA扩增试剂盒均购自thermo公司，CCK8试剂盒，凋亡试剂盒，周期试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人食管癌细胞株ECA109使用含10%血清的高糖DMEM培养基，37℃、5%CO2、95%相对湿度条件培养。采用甘草甜素处理的细胞设定为实验组，甘草甜素未处理的细胞设定为对照组。

1.2.2CCK8检测食管癌细胞的增殖情况 取对数生长期的细胞，细胞数量控制在5 000个/孔，5个复孔，37℃，5%CO2培养放置24 h。待细胞贴壁后，对照组中加入不含甘草甜素1%血清的DMEM培养基，实验组中分别加入含12.5，25.0，50.0，100.0，200.0，400.0 μmol/L甘草甜素的1%血清的DMEM培养基，分别培养24、48、72 h后，每孔中加入10 μl的CCK8于37℃，5%CO2培养箱中培养2 h，以不含细胞和甘草甜素作为实验的空白对照组。于酶标仪(BIO-RAD680)上检测450 nm波长处各组的吸光度值并计算IC50值。细胞抑制率=1-(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%。实验重复3次以上。

1.2.3流式细胞仪检测食管癌细胞的凋亡情况 取对数生长期的细胞，消化后以5×105个/ml均匀接种于6孔板中，待24 h细胞贴壁后，对照组和实验组中分别加入不含甘草甜素的培养基和含200 μmol/L 甘草甜素的培养基处理细胞24 h。PBS清洗两次，消化收集各组细胞加入500 μl结合缓冲液重悬，依次加入Annexin-V，PI各5 μl。于1 h内在流式细胞仪(BD FACSCanto Ⅱ)上检测，用Cell Quest软件检测并分析细胞凋亡和死亡情况。结果判定：异硫氰酸荧光素(FITC-)/碘化丙啶(PI-)为活细胞，FITC-/PI+为坏死细胞，FITC+/PI-为早期凋亡细胞，FITC+/PI+为晚期凋亡细胞。细胞凋亡率/%=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/全部细胞数×100%。实验重复3次以上。

1.2.4流式细胞仪检测食管癌细胞的周期情况 取对数生长期的细胞，消化后以5×105个/ml均匀接种于6孔板中，待24 h细胞贴壁后，对照组和实验组中分别加入不含甘草甜素的培养基和含200 μmol/L甘草甜素的培养基处理细胞24 h。PBS清洗两次，加入含75%乙醇的1×结合缓冲液重悬，调整细胞数量至1×105个/ml，4℃固定12 h以上。固定完后收集细胞加入RNaseA反应30 min，5 μl PI室温避光反应20 min。于1 h内在流式细胞仪上检测，按Cell Quest软件检测并分析细胞周期情况。实验重复3次以上。

1.2.5RT-PCR检测食管癌细胞中mRNA的表达 取对数生长期的细胞，将试验分为对照组和实验组。实验组细胞分别加入含50 μmol/L和200 μmol/L 甘草甜素的10%血清DMEM高糖培养基，对照组加入不含甘草甜素的10%血清DMEM高糖培养基。处理24 h后按照Trizol试剂说明书提取细胞中的RNA，将细胞RNA反转录成cDNA,然后扩增成DNA(所有步骤严格按照逆转录试剂盒和扩增试剂盒说明书操作)。bax引物序列，上游：5′-TGTCTGTCTTGTCCCCTTCC-3′，下游：5′-ACCTTGAGCACCAGTTTGCT-3′；bcl-2上游：5′-TCCATGTCTTTGGACAACCA-3′，下游：5′-CTCCACCAGTGTTCCCATCT-3′；p53上游：5′-CCCTCTACAACATCACCACG-3′，下游：5′-TCCCTTTCAGCAGGTCAGA-3′；以GAPDH作为内参，上游：5′-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3′；下游：5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。所有引物序列均由上海生物工程技术有限公司合成。RT-PCR反应条件如下：95℃预变性10 min，然后95℃变形30 s，50℃退火30 s，70℃延伸1 min，40个循环，最后70℃延伸10 min结束。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统(Bio-Rad，USA)测条带灰度，以目的基因与内参基因GAPDH灰度值的比值反映目的基因的相对表达量。实验重复3次以上。

1.2.6Western印迹检测食管癌细胞中的蛋白表达 取对数生长期的细胞，将试验分为对照组和实验组。实验组细胞分别加入含50 μmol/L和200 μmol/L 甘草甜素的10%血清DMEM高糖培养基，对照组加入不含甘草甜素的10%血清DMEM高糖培养基。处理24 h后按照RAPI裂解液说明书提取细胞中的总蛋白。采用BSA法定量细胞总蛋白。采用12%SDS-PAGE电泳2 h分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4℃过夜，PBS清洗后加入二抗〔IgG(1∶2 000)〕，37℃孵育2 h，最后电化学发光显影后用凝胶成像分析系统(Bio-Rad，USA)测蛋白条带光密度值。本实验选用GAPDH作为内参对照。实验重复3次以上。

2 结 果

2.1甘草甜素对食管癌细胞增殖的影响 随着甘草甜素处理时间的延长和处理浓度的增加，甘草甜素对食管癌细胞增殖的抑制作用逐渐增加，具有时间-剂量依赖性。食管癌细胞在相同剂量甘草甜素不同处理时间的细胞抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同剂量甘草甜素处理相同时间的细胞抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。甘草甜素作用于食管癌细胞24、48、72 h的IC50值分别为187.34 μmol/L，98.25 μmol/L和69.21 μmol/L。

表1 不同浓度甘草甜素处理不同时间后食管癌细胞的抑制率比较

2.2甘草甜素对食管癌细胞凋亡的影响 与对照组〔细胞凋亡率(8.69±0.91)%〕相比，50.0 μmol/L〔凋亡率(22.74±1.85)%〕与200.0 μmol/L〔凋亡率(47.29±3.21%)〕浓度的甘草甜素处理后的食管癌细胞的凋亡率明显增加，差异有统计学意义(t=5.987,P=0.004；t=14.732,P=0.000)。

2.3甘草甜素对食管癌细胞周期的影响 通过流式细胞仪检测不同浓度甘草甜素处理食管癌细胞24 h后DNA含量分析，结果显示，与对照组相比，50.0 μmol/L与200.0 μmol/L浓度的甘草甜素能明显阻滞细胞在G1期，差异有统计学意义(t=6.032,P=0.003；t=8.752,P=0.002)。见表2。

2.4甘草甜素对食管癌细胞mRNA表达的影响 随着甘草甜素处理浓度的增加，食管癌细胞中bax与p53的mRNA表达明显增加(P<0.05)，而bcl-2的mRNA表达随着甘草甜素处理浓度的增加而降低(P<0.05)。见图1，表3。

表2 甘草甜素对食管癌细胞的周期影响情况

与对照组比较：1)P<0.05

图1 甘草甜素对食管癌细胞中bcl-2，bax，p53 mRNA表达的影响

表3 甘草甜素对食管癌细胞中bcl-2，bax，p53 mRNA表达的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与50.0 μmol/L比较：2)P<0.05，下表同

2.5甘草甜素对食管癌细胞蛋白表达的影响 随着甘草甜素处理浓度的增加，食管癌细胞中bax与p53蛋白的表达明显增加(P<0.05)，而bcl-2 蛋白的表达随着甘草甜素处理浓度的增加而降低(P<0.05)。随着甘草甜素处理浓度的增加，食管癌细胞中bax/bcl-2的比例逐渐增加(P<0.05)。见图2，表4。

图2 甘草甜素对食管癌细胞中bcl-2，bax，p53蛋白表达的影响

表4 甘草甜素对食管癌细胞中bcl-2，bax，p53蛋白表达的影响

3 讨 论

目前治疗食管癌的手段还是首选手术切除，但是由于食管癌的具有高侵袭、高转移的生长特性导致患者治疗效果和预后不佳。所以化疗成为食管癌主要的治疗手段〔5〕。

研究显示，中医药能够在宏观上对机体起到调节作用，在病情的延缓，控制和防止复发等方面有很好的疗效〔6〕。甘草甜素是甘草中最重要的生物活性物质，主要存在于甘草根表皮以内的部位，其广泛的抗肿瘤活性主要体现为增强外周血单个细胞分泌肿瘤坏死因子的作用，在体内也可以增强机体自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的毒性活力〔7,8〕。研究发现甘草甜素能够抑制人胃癌细胞KATOIII和白血病细胞HL-60的增殖，并且抑制作用随着作用时间的延长和作用强度的增加而增加〔9〕。而在体外实验中Shiota等〔10〕研究发现甘草甜素能够抑制肝癌的生长。同时也有研究发现甘草甜素对前列腺癌细胞和结肠癌细胞有抑制的作用〔3,11〕。而本研究结果提示甘草甜素对ECA109细胞的增殖能力的影响具有时间-剂量的依赖性，与有关研究报道一致〔12〕。

细胞周期的进程阻滞与凋亡的受阻是肿瘤细胞无限增殖的原因之一。有研究发现，甘草甜素具有诱导结肠癌细胞SW-1116凋亡的作用，并且与甘草甜素作用的浓度和时间呈正相关，同时甘草甜素能够将SW-1116细胞明显阻滞在G1期〔3〕。本研究通过流式细胞仪检测50.0 μmol/L和200.0 μmol/L浓度甘草甜素作用于食管癌细胞ECA109时的周期和凋亡情况，发现各组浓度的甘草甜素处理后的细胞周期和凋亡与对照组均发生了明显的改变；50.0 μmol/L和200.0 μmol/L甘草甜素作用后的ECA109细胞周期被明显阻滞于G1期，凋亡率也明显增加。这可能是甘草甜素延长细胞G1期时间而抑制细胞增殖，但是具体的机制还不清楚。

Bcl-2家族基因与p53基因都是调控细胞凋亡的重要基因。bcl-2与bax是Bcl-2家族中最具代表性的两种基因，分别起着抑制凋亡与促进凋亡的作用〔13〕。当细胞内bcl-2相对占优势时，bcl-2将会与bax形成异源二聚体导致凋亡受到抑制；而当细胞内bax占据优势时，bax本身形成同源二聚体促进凋亡的发生〔14〕。因此bax/bcl-2的比值对于细胞进入凋亡与否及凋亡程度有重要意义。本研究发现甘草甜素作用食管癌细胞24 h后，随着浓度的增加，细胞中bcl-2的表达呈降低的趋势，而bax的表达逐渐增高，并且bax/bcl-2的比例也逐渐增加，提示甘草甜素通过上调促进凋亡的bax基因，使bax本身形成同源二聚体，加速细胞的凋亡。野生型p53是一种促进细胞凋亡基因，可以通过多种途径激活下游的促凋亡基因诱发细胞的凋亡〔15〕。有研究发现在p53突变的乳腺癌细胞中，苯乙双胍对细胞的促凋亡作用受到抑制，而当乳腺癌细胞中突变型的p53恢复至野生型时，苯乙双胍对细胞的促凋亡作用得到加强，提示p53在药物的抗肿瘤方面发挥着重要的作用〔16〕。本研究发现甘草甜素作用24 h后的食管癌细胞中p53的表达明显增加，并随着浓度增加而增加，提示甘草甜素可能通过上调食管癌细胞中p53的表达发挥促进细胞凋亡的作用。

综上所述，甘草甜素能够延长细胞G1期时间而抑制细胞增殖，促进其凋亡，可能通过调控bax，bcl-2及p53多种凋亡相关基因的表达来实现，提示甘草甜素有可能作为一种新型的辅助用药用于食管癌的治疗，为临床上食管癌的治疗提供新的依据与参考。

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